体内模块化抗体–ADC点击化学逆转肿瘤耐药

《Nature》：Modular in vivo antibody–ADC click to reverse drug resistance in tumours

　　

抗体–药物偶联物（Antibody–drug conjugates，ADC）通过在肿瘤细胞选择性递送细胞毒性药物显著推进了癌症治疗。然而，ADC疗效仍受限于其对单一靶抗原的依赖，这限制了肿瘤靶向并在抗原表达可变且低的异质性肿瘤中促进耐药。在此，研究人员引入一种体内生物正交连接策略，在全身给药后生成功能性抗体–ADC点击构建体。该平台为异质性肿瘤中增强靶向药物递送提供了一种模块化且可转化的方法。研究人员将治疗性抗体和ADC分别与反式环辛烯（trans-cyclooctene，TCO）和四嗪（tetrazine）基团偶联以实现序贯给药，从而在全身递送后实现抗体与ADC的体内连接。在HER2和EGFR共表达的临床前模型中，相对于标准ADC单药治疗或抗体加ADC联合方案，抗体–ADC点击方法显示出改善的抗肿瘤活性。这些模型包括HER2低、超低、阴性或异质性表达以及对常规HER2导向ADC耐药或不符合资格的肿瘤。这种模块化策略利用受体生物学和生物正交化学实现最佳治疗效果，且不需要广泛的抗体重新工程化。此外，抗体–ADC点击方法可扩展至其他受体对，这使其成为解决不同肿瘤类型中异质性和靶向治疗耐药的灵活模块化平台。

研究背景方面，目前已获批的约十几种抗体–药物偶联物（ADC）在临床取得成功，但其疗效受限于细胞表面高且均匀的抗原表达及有效内化，肿瘤异质性、代偿性信号传导和抗原丢失导致耐药，使许多患者不符合常规ADC治疗或产生难治性。为克服ADC单抗原靶向局限，虽探索了抗体组合和双特异性抗体，但依赖抗体独立生物分布，在异质性肿瘤中可能不理想。生物正交点击化学可在体内快速选择性连接，反电子需求Diels–Alder环加成介于反式环辛烯（trans-cycloctene，TCO）与四嗪之间已用于预靶向，本研究据此提出抗体–ADC点击策略，用抗体–TCO和ADC–四嗪作为靶向与反应组分，促进体内形成针对同一靶不同域或不同肿瘤靶的功能性抗体–ADC构建体，无需广泛抗体重工程化，以解决异质性与耐药肿瘤靶向递送问题，该研究发表于《Nature》。

主要关键技术方法包括：构建HER2与EGFR瘤内异质性模型并分析临床标本中二者表达空间关系；通过N-羟基琥珀酰亚胺酯反应随机偶联或酶法位点特异性偶联将抗体与ADC修饰TCO或四嗪；采用SDS–PAGE、低温透射电镜（cryo-TEM）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）等验证点击反应与复合物形成；利用荧光定量、共聚焦显微镜、pHrodo内吞实验评估细胞水平内吞与溶酶体转运；借助锆-89（⁸⁹Zr）或铜-64（⁶⁴Cu）放射标记抗体进行正电子发射断层扫描（PET）–计算机断层扫描（CT）成像与离体生物分布分析；在多种临床前肿瘤模型（包括NCIN87、A431、MIAPaCa-2、BT474曲妥珠单抗耐药株、CT26-hHER2免疫活性模型及双侧、混合异质性模型）中开展治疗效果与生存分析，并以位点特异性修饰优化批次变异与脱靶积累评估安全性。

研究结果部分保留小标题并简述如下：

优化抗体–ADC点击：研究人员通过分析临床标本确认HER2与EGFR在空间上区分，将FDA批准的抗HER2、抗EGFR抗体与ADC分别偶联TCO与四嗪，序贯给药实现动态体内连接；点击反应在等摩尔比30分钟内形成高分子量物种，血清中保持反应性，cryo-TEM证实点击后抗体簇集，偶联不影响细胞结合，体内序贯给药后循环抗体水平渐降，验证生理条件下TCO与四嗪修饰抗体的生物正交反应性及体内共价连接形成。

抗体点击增强内化：在HER2⁺EGFR^lowNCIN87与HER2^–EGFR^highMIAPaCa-2等细胞系中，序贯给药的点击修饰抗体较非点击组合荧光强度更高；pHrodo标记的trastuzumab–tetrazine在点击条件下内吞与晚期内体/溶酶体转运显著增加，LAMP1免疫染色显示点击抗体与溶酶体囊泡共定位，表明靶向两不同受体的抗体点击较非点击组合增强HER2靶向抗体内化。

抗体点击增强肿瘤摄取：在HER2⁺EGFR^lowNCIN87移植瘤中，⁶⁴Cu标记trastuzumab–tetrazine生物分布显示肿瘤摄取22.4±6.4%ID g^–1、肝脏清除8.4±0.69%ID g^–1；双侧模型（右肩NCIN87、左肩HER2^ULEGFR^highA431）中，单药trastuzumab在A431摄取低（3.75±0.64%ID g^–1），而panitumumab–trastuzumab点击组A431摄取增至11.90±0.82%ID g^–1（3.2倍提升），NCIN87维持31.63±3.29%ID g^–1；对照IgG点击显示摄取由抗原导向肿瘤参与驱动而非仅点击加合物，双特异性抗体摄取低于5%ID g^–1且非肿瘤器官蓄积明显，证明抗体点击可促进不同HER2表达水平肿瘤的anti-HER2抗体摄取。

抗体–ADC点击增强疗效：在NCIN87瘤中，10 mg kg^–1剂量下点击组瘤重较非点击组低3.7倍；降至5 mg kg^–1单次剂量仍有效且无体重减轻等毒性。双侧模型中，T-DXd点击较生理盐水与非点击组延缓A431与NCIN87进展（P=0.0138、P=0.00976），NCIN87完全缓解率100%；免疫活性HER2^low异种移植中pertuzumab–T-DXd点击完全缓解率50%，非点击约14%，表明HER2靶向T-DXd与panitumumab或pertuzumab点击可增强不同HER2水平肿瘤疗效。

抗体–ADC在难治肿瘤中的疗效：在HER2^–胰腺癌、HER2^low混合乳腺癌模型中，T-DXd或T-DM1单药及非点击联合反应极小，而panitumumab–TCO与T-DM1–四嗪或T-DXd–四嗪点击显著降低瘤体积并延长生存；非靶向IgG–DM1–四嗪点击无获益，说明需抗原导向肿瘤参与；T-DXd耐药NCIN87非应答者EGFR上调，切换为panitumumab–TCO加T-DXd–四嗪点击后5/9抑制生长；BT474曲妥珠单抗耐药瘤中T-DXd非应答者经pertuzumab–TCO加T-DXd–四嗪点击后5/6抑制肿瘤，证明该策略可增强低/异质靶表达及难治肿瘤ADC疗效。

位点特异性改进抗体–ADC点击：针对随机赖氨酸偶联批次变异，采用酶法在抗体Fc糖基化位点特异修饰叠氮再与二苯并环辛炔（DBCO）–TCO/四嗪连接，每抗体偶联2–4个基团，SDS–PAGE与cryo-TEM证实交联与Fc区共价连接，适用于HER2、EGFR、PD-L1、PSMA、VEGF等多抗体。双侧模型中位点特异性点击肝蓄积较随机降低2倍（P=0.0064），血清学安全；在HER2^–MIAPaCa-2中，⁸⁹Zr-trastuzumab–ss-四嗪点击组120小时肿瘤蓄积24.93±2.75最大%ID ml^–1，高于对照IgG点击（18.46±2.72）与预点击（12.67±1.72），肝蓄积反之；该点击在胰腺癌与混合乳腺癌模型维持抗肿瘤活性，说明位点特异性在保持靶向同时减少脱靶，尤其肝脏，利于转化。

讨论部分总结：常规ADC限于单抗原靶向，在异质性与可变靶表达肿瘤疗效受限；本研究引入抗体–ADC点击，用FDA批准抗体与ADC序贯全身给药，通过反电子需求Diels–Alder生物正交点击（k₂>100,000 M^?1s^?1）体内选择性连接，部分在血液循环、部分在肿瘤内形成点击复合物，经抗原介导靶向蓄积与受体生物学增强ADC内化，无需广泛抗体骨架改造即可实现多特异性靶向；该策略使ADC摄取不单纯依赖其靶表达，共靶向低内化与快内化抗原可递送载荷，效果非常规抗体组合达成，获益来自生物正交连接与肿瘤受体生物学共同结果；以HER2靶向ADC（T-DXd、T-DM1）为概念验证，在异质性瘤扩展至无HER2或HER2耐药肿瘤，安全性相似，位点特异性修饰较随机减少肝蓄积这一脱靶毒性关键决定因素；虽聚焦HER2，但可适配其他靶，兼容不同Fc效应功能，具细胞毒与免疫调节潜力；未来需优化点击手柄间化学连接子、提升体内连接精确控制、位点特异性提升一致性药代与疗效、优化构建体大小与价态以增强实体瘤穿透；综上，抗体–ADC点击为下一代靶向治疗提供灵活高效低成本平台，兼容临床验证抗体、体内组装无需重工程化，以最小附加成本应对肿瘤异质性，除细胞毒递送外还可诊断成像与组合载荷，为肿瘤学及其他疾病抗体治疗优化提供基础。

研究结论部分翻译：常规抗体–药物偶联物（ADC）在癌症治疗中显示出重要前景，但固有地限于靶向单一抗原，这可能限制其在具有可变靶表达的异质性肿瘤中的治疗效果。在此，研究人员介绍了一种抗体–ADC点击方法，用于将FDA批准的抗体与HER2靶向ADC进行体内连接。结果表明，用点击基团修饰抗体可保留靶向结合，同时改善肿瘤蓄积，尤其在HER2蛋白水平异质、超低或阴性的肿瘤模型中，且未观察到脱靶蓄积增加。研究人员利用生物正交点击化学在活体系统中功能化生物分子的高度选择与生物相容方法进行抗体与ADC的体内连接。在这项工作中，FDA批准的抗体与ADC序贯给药，并通过反电子需求Diels–Alder化学在体内选择性连接，这是一种具有优异反应动力学的生物正交点击反应（k₂>100,000 M^?1s^?1）。体内Diels–Alder化学已成功应用于放射化学与药物递送，最常见是利用预靶向抗体与非靶向小分子药物，而抗体–ADC点击方法利用肿瘤靶向抗体与ADC在体内连接。鉴于抗体循环时间，一部分抗体与ADC在肿瘤蓄积前在血液中连接，循环形成的抗体–ADC点击复合物随后通过抗原介导靶向在肿瘤蓄积，且抗体–TCO可与已蓄积于肿瘤的抗体–四嗪点击。观察到的抗体–ADC点击物种治疗作用来自系统与肿瘤生物正交连接及肿瘤特异性生物学靶向组合，最终增强ADC内化。抗体–ADC点击方法最大限度减少抗体骨架广泛修饰需求，同时实现多特异性靶向。序贯全身给药与体内连接后，抗体–ADC点击物种保持靶参与，并在整个HER2表达谱的EGFR^high或EGFR^low肿瘤中显示改善的肿瘤蓄积与疗效。该方法优势可能推广至其他靶，即点击ADC摄取不完全依赖于其靶的表达水平或其他属性，因此共靶向差内化抗原与快内化抗原可能实现载荷递送，即使单靶高度肿瘤特异性但因动态表达与降解不适合长寿命抗体构建体靶向；此背景下，内化实验证明EGFR^high与EGFR^low肿瘤模型中用抗体–ADC点击方法增加HER2靶向抗体内化，提示受体生物学在调节摄取中作用，且该效应非常规抗体组合实现，虽点击条件下观察更高内化，但无法明确区分增强受体介导摄取、抗体簇集或体内两抗体连接所致药代动力学改变，因此治疗获益可能反映生物正交化学驱动连接与肿瘤受体生物学组合而非仅受体共定位组装；此外，该方法模块化允许灵活偶联同时保持亲本抗体功能属性，作为生成抗体基偶联物的可转化策略具潜力。本研究开发抗体–ADC点击以HER2靶向ADC（T-DXd与T-DM1）为概念验证，改善异质肿瘤ADC摄取并将HER2靶向ADC治疗潜力扩展至缺乏HER2表达或HER2导向治疗耐药肿瘤；T-DXd与T-DM1有完善安全谱，点击偶联物显示相似生物分布与安全属性，表明其临床转化潜力，且位点特异性非随机抗体修饰较随机叔胺导向偶联减少肝蓄积，而肝摄取是ADC脱靶毒性与耐受性关键决定因素，对某些载荷（如DXd诱导肺毒性）已知风险需在人源化模型进一步评估与优化给药策略。虽聚焦HER2靶向ADC，但该方法固有灵活可适配其他感兴趣靶，因此潜在适用于广泛肿瘤类型，尤其异质或低抗原表达特征者；该方法模块化也可整合不同Fc域或效应功能抗体，进一步为细胞毒与免疫调节治疗策略创造新机会。需进一步开发与优化点击启用ADC平台以未来临床转化，例如优化抗体与可点击手柄（TCO或四嗪）间化学连接子或间隔子可进一步改善药代属性；此外，优化抗体–ADC点击系统可提升有效性并实现多样生物学背景与异质肿瘤微环境中两抗体体内连接更精确控制；位点特异性偶联策略将进一步改善一致性、药代与疗效；优化抗体构建体大小与价态（如用片段或工程化支架）可增强肿瘤穿透、减少脱靶效应并更好利用受体簇集效应，尤其在基质致密或血管差实体瘤。综上，该抗体–ADC点击策略为下一代靶向治疗提供灵活、高效、成本效益平台，兼容临床验证抗体且无需广泛抗体重工程化实现体内组装，以最小附加成本应对肿瘤异质性，除直接细胞毒递送外，该方法模块定制为免疫调节、诊断成像与组合载荷策略提供潜力，因此为肿瘤学与其他疾病中抗体治疗优化提供灵活基础。