突触Ca2+通道与神经连接蛋白通过直接和间接结合复合物连接

《Scientific Reports》：Synaptic Ca2+ channels and neurexins are linked through direct and indirect binding complexes

　　

神经递质从突触前终末的快速释放对脑功能至关重要，由通过电压门控钙通道（voltage-gated calcium channels，VGCCs）的Ca²⁺内流触发，VGCCs由α1孔形成亚基、胞内β亚基和大多为胞外的α2δ辅助亚基组成。神经连接蛋白（neurexins，Nrxn）调控神经传递和突触前Ca²⁺内流，但其与VGCC亚基的物理相互作用仍未知。在此，研究人员使用基于纳米抗体的共沉淀系统，在重组VGCC-Nrxn复合物中检查了这些相互作用。研究人员发现，α2δ-1和α2δ-3变体以不同的偏好性结合Ca_V2.1和Ca_V2.2型VGCC的α1孔形成亚基，而Nrxn1α和Nrxn1β不与α1直接相互作用。由于Nrxn1α结合两种α2δ变体，但Nrxn1α/α2δ复合物不包含α1，移动的α2δ亚基可能在Nrxn1α和Ca_V核心之间动态切换。此外，Nrxn1α通过胞内支架蛋白Mint2与α1亚基发生不依赖α2δ的关联，而Mint2通过抑制α2δ的完全糖基化增强Nrxn1α/α2δ复合物形成。胞外较短的Nrxn1β不能结合α2δ，但可通过Mint2或CASK蛋白间接与Ca_V2 α1孔形成亚基关联。因此，研究人员的发现揭示了αNrxn和βNrxn变体与VGCC亚基相互作用以调控突触前Ca²⁺内流的不同分子复合物。

**论文解读：突触Ca²⁺通道与神经连接蛋白结合复合物的分子机制**

**研究背景与问题**

突触传递是神经元通信的核心，依赖于突触前终末的神经递质快速释放。这一过程主要由通过电压门控钙通道（voltage-gated calcium channels，VGCCs）的Ca²⁺内流触发。VGCCs（特别是Ca_V2.1 P/Q型和Ca_V2.2 N型）由孔形成α1亚基、胞内β亚基和大多胞外的α2δ辅助亚基组成。神经连接蛋白（neurexins，Nrxn）是关键的突触前跨膜蛋白，调控神经递质释放和突触前Ca²⁺内流。此前研究发现，αNrxn和βNrxn的敲除会降低突触前Ca²⁺内流和Ca²⁺通道依赖的诱发释放，但Nrxn与VGCC亚基之间的直接物理相互作用仍不明确。特别是，α2δ蛋白与Nrxn的功能和物理联系已被报道，但具体的分子决定因素尚待阐明。此外，Nrxn变体（αNrxn和βNrxn）与不同VGCC亚基之间的结合偏好性及间接连接途径也不清楚。因此，开展本研究以系统解析突触VGCC亚基与Nrxn之间的直接和间接结合模式。

**研究概要**

研究人员在《Scientific Reports》上发表了这项研究，通过在HEK293细胞中重组表达Ca_V2.1和Ca_V2.2通道亚基（α1A、α1B、β3、α2δ-1、α2δ-3）以及Nrxn1α、Nrxn1β变体，利用基于纳米抗体的共沉淀系统（nanobody-based co-precipitation）和免疫印迹分析，系统探究了这些蛋白之间的物理结合关系。同时结合三重分裂超折叠NeonGreen（triple-split sfNG）荧光互补技术、糖基化抑制剂处理、结构建模等方法，揭示了多种分子复合物的形成机制。研究发现，α2δ亚基与α1亚基或Nrxn1α之间存在竞争性结合，而Nrxn则通过Mint或CASK支架蛋白间接连接至α1亚基，且Mint可通过抑制α2δ糖基化增强Nrxn1α/α2δ复合物形成。这些发现阐明了突触前Ca²⁺内流调控的分子基础。

**主要关键技术方法**

研究人员采用基于纳米抗体的磁珠共沉淀系统（anti-GFP、anti-SPOT、anti-ALFA纳米抗体），从转染的HEK293细胞（工具细胞系）的洋地黄皂苷裂解液中纯化重组蛋白复合物，并通过免疫印迹（Western blot）检测亚基相互作用。同时应用三重分裂超折叠NeonGreen（sfNG）荧光互补技术，在活细胞表面可视化Nrxn1α与α2δ的复合物。此外，使用Tunicamycin抑制N-糖基化，结合AlphaFold结构建模和Glycam服务器预测糖基化模式。未涉及特定样本队列来源，仅使用HEK293细胞和293-F细胞进行重组蛋白表达。

**研究结果**

**1. 孔形成α1亚基对α2δ存在偏好性但不结合αNrxn：** 通过纳米抗体共沉淀实验发现，α1A（Ca_V2.1孔形成亚基）对α2δ-1的结合显著强于α2δ-3，结合比例约为α1B（Ca_V2.2孔形成亚基）的三倍。而无论使用何种α2δ变体，Nrxn1α均不与α1A或α1B直接共沉淀。反向实验表明，GFP标记的Nrxn1α可沉淀α2δ-1，但不沉淀α1A或β3亚基，证明Nrxn1α直接结合α2δ而非α1。

**2. α2δ/Nrxn1α复合物存在于细胞表面：** 通过三重分裂sfNG系统，在HEK293细胞表面检测到Nrxn1α与α2δ-1或α2δ-3形成的荧光复合物，且抗ALFA纳米抗体可从细胞裂解液中共沉淀出该复合物，证实了细胞表面Nrxn1α/α2δ的存在。

**3. 多个Nrxn1α胞外LNS结构域冗余结合α2δ：** 截短实验表明，Nrxn1β（不含LNS1-5）不能结合α2δ。分离的LNS结构域分析显示，α2δ-1可结合LNS1、LNS2、LNS3和LNS5，而α2δ-3仅结合LNS1、LNS2和LNS3，提示多个LNS结构域参与冗余结合。

**4. Nrxn1α与α2δ的结合与糖基化呈负相关：** 通过构建不同糖基化程度的Nrxn1α突变异构体（去除O-糖基化或硫酸乙酰肝素），发现完全去除O-糖基化的pg-linker突变体使α2δ-1结合增加约3倍，α2δ-3结合增加约5倍。结构建模显示α2δ-3的N-糖基化覆盖面积小于α2δ-1，这与去糖基化后α2δ-3结合增强更显著一致，说明糖基化负调控两者结合。

**5. Nrxn1α与α2δ的结合依赖膜锚定：** 分泌型胞外结构域（ECD）实验显示，单独分泌的Nrxn1α-ECD与α2δ-ECD在溶液中不形成复合物，但膜锚定的全长Nrxn1α可沉淀α2δ-ECD，且用GPI锚替代α2δ的C端也不影响结合，证明Nrxn1α的膜锚定是结合所必需的。

**6. Mint2间接连接Nrxn与α1并降低α2δ糖基化：** 通过SPOT-trap共沉淀发现，全长Mint2可介导Nrxn1α与α1B的间接结合，而缺失PDZ结构域的Mint2ΔPDZ则无效。有趣的是，全长Mint2与Nrxn1α共同表达时，α2δ-1的分子量降低至约140 kDa（正常约>150 kDa），Tunicamycin（N-糖基化抑制剂）处理进一步降低至125 kDa，表明Mint2通过Nrxn抑制α2δ-1的完全N-糖基化，从而增强Nrxn1α/α2δ复合物形成。CASK蛋白可连接Nrxn1β（而非Nrxn1α）至α1B，但不影响α2δ糖基化。

**总结与结论**

**讨论总结：** 研究人员通过重组蛋白系统系统鉴定了VGCC亚基与Nrxn之间的多种直接和间接结合模式。α2δ亚基（特别是α2δ-1对α1A）具有结合偏好性，但Nrxn1α不直接结合α1，而是与α2δ竞争性结合，且依赖膜锚定和多个LNS结构域。糖基化水平反向调控Nrxn1α/α2δ结合。此外，Mint1/2支架蛋白不仅通过PDZ结构域桥接Nrxn（α和β变体）与α1亚基，还通过抑制α2δ的完全N-糖基化促进Nrxn/α2δ复合物形成。CASK则特异性连接βNrxn至α1。这些发现解释了此前功能研究中观察到的Nrxn对VGCC活性的调控，并提出了α2δ亚基在Nrxn与VGCC核心之间动态切换的“弹球模型”。研究采用的纳米抗体共沉淀系统有效避免了传统免疫沉淀中α2δ与Fc片段或蛋白A的非特异性结合问题。

**研究结论：** 因此，研究人员的发现揭示了αNrxn和βNrxn变体与VGCC亚基相互作用以调控突触前Ca²⁺内流的不同分子复合物。