《Nature》：Metabolite glues as a means of purine sensing and chemotherapeutic response
编辑推荐：
摘要：分子胶水（molecular glues）能稳定弱相互作用，从而赋予复合物新的功能。尽管分子胶水已在植物信号传导和人类治疗中被描述，但尚不清楚这种形式是否在人类细胞中提供内源性调控。研究人员在此表明，嘌呤核苷酸（purine nucleotides）是分
摘要：分子胶水（molecular glues）能稳定弱相互作用，从而赋予复合物新的功能。尽管分子胶水已在植物信号传导和人类治疗中被描述，但尚不清楚这种形式是否在人类细胞中提供内源性调控。研究人员在此表明，嘌呤核苷酸（purine nucleotides）是分子胶水，能将嘌呤生物合成中的限速酶——磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶（phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase, PPAT）——与其抑制剂NUDT5连接在一起。这种机制使细胞能够感知嘌呤水平，并对其合成建立必要的反馈控制。研究人员将这类分子称为代谢胶水（metabolite glues）。自20世纪50年代起已在临床使用的硫嘌呤化疗药物（thiopurine chemotherapeutics）能胶合同一复合物，但采用不同的取向以增强功能。与大多数已知胶水不同，PPAT–NUDT5代谢胶水口袋能根据显著的化合物改变而调整其构象，从而实现更高的胶水效力并改善靶向活性。因此，研究人员将内源性代谢胶水识别为一种营养感知模式，该模式可被利用以获得治疗益处。
**代谢胶水作为嘌呤感知与化疗响应机制的解读**
**研究背景与问题**
细胞从共同前体合成不同代谢物的能力对组织形成和稳态至关重要，负责这些过程的生物合成途径必须快速适应增殖、分化或应激期间代谢需求的频繁变化。这需要持续监测并调整代谢前体和产物水平的调控回路。营养感知和反馈控制的丧失导致一些系统性疾病（如糖尿病）和发育病理——例如PRPS1突变或Lesch–Nyhan综合征患者中观察到的嘌呤代谢失调。嘌呤从头生物合成是最关键且能量需求最高的代谢途径之一，它利用ATP、氨基酸、线粒体衍生的辅因子和核糖-5-磷酸生成核苷酸，以供给增殖、核酸合成、信号传导和生物能量学。为防止代谢构建模块的过度消耗或错误分配，嘌呤从头合成受终产物抑制调控。反之，高嘌呤需求通过别构酶激活、多酶嘌呤体（purinosome）形成、酶纤维组装以及mTORC1或RAS–ERK信号传导来刺激产生。回收途径通过以较低能量成本回收核碱基来补充这一过程。同位素示踪显示大多数组织同时依赖从头合成和回收途径，表明存在需要协调的机制，但尚不完全清楚。尽管嘌呤合成酶在所有生命界中保守，但其调控知识多来自细菌研究，后生动物可能进化出额外复杂性以适应独特的代谢需求。由于嘌呤代谢对细胞存活的重要性，它已被广泛用于癌症、自身免疫疾病和器官移植排斥的治疗，包括抗叶酸药物（如甲氨蝶呤，MTX）和硫嘌呤（如6-巯基嘌呤，6-MP），这些药物仍是当今癌症治疗的基石。MTX消耗嘌呤合成所需的代谢辅因子，而6-MP被认为至少部分通过掺入DNA发挥作用。两种药物均诱导DNA损伤以导致癌细胞死亡，但表现出脱靶毒性，限制了治疗效果。由于嘌呤可用性限制细胞增殖和免疫激活，识别感知和调整嘌呤生物合成的调控机制可能揭示利用这一过程进行癌症治疗和免疫抑制治疗的策略。研究人员在此表明，嘌呤从头合成受内源性分子胶水（称为代谢胶水）调控。对嘌呤合成限速酶PPAT的结构研究揭示了嘌呤单磷酸化合物将PPAT抑制剂NUDT5锚定在PPAT活性位点。该机制使细胞能够监测嘌呤水平，并为嘌呤生物合成提供必要的反馈控制。硫嘌呤化疗药物作为同一复合物的分子胶水，但在蛋白质界面采用改变的结合模式，将PPAT的构象变化转化为效力增强的胶水。值得注意的是，研究人员可以利用这个胶水口袋的结构灵活性来提高硫嘌呤效力和靶向活性。因此，该研究将代谢胶水识别为一种营养感知模式，并为合理发现治疗相关的分子胶水提供了起点。
**主要关键技术方法**
研究人员采用了以下关键技术方法：1）基于CRISPR的代谢物聚焦遗传筛选，使用针对约3000种代谢酶和转运体的单导向RNA（sgRNA）文库，在骨肉瘤U2OS细胞中结合亚致死剂量CRL抑制剂MLN4924进行化学遗传相互作用鉴定；2）亲和纯化结合质谱蛋白质组学鉴定NUDT5相互作用蛋白；3）冷冻电镜（cryo-EM）技术解析PPAT–NUDT5复合物与不同核苷酸配体的高分辨率结构（最高2.4 ?）；4）AlphaFold结构预测辅助建模；5）基于荧光素酶的PPAT酶活测定；6）AlphaLisa结合实验及质量光度法（mass photometry）分析复合物组装与解离；7）稳定同位素（[15N-酰胺]-谷氨酰胺）示踪结合液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测嘌呤从头合成通量；8）在多种人细胞系（HEK293T、Expi293F、MOLT4、Jurkat、NALM6等急性淋巴细胞白血病（ALL）亚型细胞）中进行CRISPR编辑构建敲除和点突变内源性细胞系，并进行药物处理竞争实验和细胞活力测定。样本来源包括商业化细胞库，无特定患者队列。
**研究结果**
**NUDT5 regulates purine synthesis**
通过CRISPR筛选发现，参与嘌呤从头合成（特别是腺苷酸生成）的酶缺失细胞对部分CRL抑制更敏感。NUDT5缺失则使细胞对MLN4924处理具有保护性。亲和纯化与质谱显示NUDT5与PPAT共免疫沉淀，且携带Y74磷酸化模拟突变（Y74E）或环区突变（R70A/L72A/Y74A）的NUDT5破坏该相互作用。催化失活突变体（E112Q/E116Q）仍能结合PPAT并恢复MLN4924敏感性。结论：NUDT5通过PPAT调控药物敏感性，且独立于其水解酶功能。
**Structure of the PPAT–NUDT5–AMP complex**
冷冻电镜解析了PPAT–NUDT5(Y74F)在AMP存在下的2.8 ?结构。NUDT5二聚体占据PPAT四聚体的每个椭圆面，形成约330 kDa复合物。每个NUDT5单体通过两个不同界面与两个PPAT原聚体接触：R70–Y74环界面（与保守疏水口袋相互作用）和C末端延伸至PPAT催化中心的“分子胶水”界面。AMP分子夹在PPAT和NUDT5之间，与蛋白质残基（PPAT的Y94、Y286、D390；NUDT5的L217、K218）接触。突变NUDT5的C末端残基（L217A/K218A）降低与PPAT的结合，证明AMP作为分子胶水将限速酶PPAT与其抑制剂NUDT5拴连。
**PPAT inhibition through metabolite glues**
酶活测定显示，AMP或NUDT5单独存在仅在非生理高浓度下抑制PPAT，而两者共存使AMP抑制PPAT的能力提高约50倍，达到内源水平。NUDT5突变（L217A/K218A）或R70–Y74环突变均损害AMP依赖的PPAT抑制。其他嘌呤（IMP、GMP、AICA-核糖核苷酸）也以类似方式抑制PPAT。质量光度法显示PPAT底物PRPP诱导PPAT–NUDT5复合物解离为PPAT四聚体和NUDT5二聚体，而AMP可保护野生型复合物免受解离。细胞实验中，MTX处理导致内源性PPAT–NUDT5复合物解离，而补充次黄嘌呤（转化为IMP/AMP/GMP胶水）则完全阻止解离。同位素示踪显示，在次黄嘌呤存在下，野生型细胞嘌呤从头合成受抑制，而NUDT5敲除或L217A/K218A突变细胞中15N掺入显著增加。结论：嘌呤作为代谢胶水稳定PPAT–NUDT5抑制性复合物，在嘌呤充足时阻断从头合成通量。
**Thiopurines are molecular glues**
ΔNUDT5细胞对6-硫鸟嘌呤（6-TG）高度抵抗。研究人员解析了2.4 ?的PPAT–NUDT5与6-MP代谢物6-甲基硫代肌苷-5′-单磷酸（6-meTIMP）复合物结构。6-meTIMP结合于与AMP相同的亚基界面，但嘌呤环采用弯曲构象，通过PPAT Y286和F287重排形成不同的π-堆积相互作用，6-甲基硫代取代基嵌入由F282、F287、I422、I430、I432组成的疏水口袋。6-meTIMP是比AMP强约70倍的PPAT抑制剂，依赖完整胶水界面。6-meTIMP胶水强效保护复合物免受PRPP诱导解离。6-MP处理细胞也阻止MTX诱导的复合物解离。NUDT5(L217A/K218A)突变细胞在6-MP存在下不能关闭嘌呤合成，且生长实验中高度抵抗硫嘌呤。在ALL细胞系（MOLT4、Jurkat、NALM6）中引入L217A/K218A突变后，细胞对治疗浓度6-meTIMP的反应降低，表明胶水机制的重要贡献。结论：硫嘌呤作为分子胶水，至少部分通过PPAT–NUDT5阻断嘌呤从头合成发挥作用。
**Design of enhanced molecular glues**
研究人员测试了更大取代基的6-苄基硫代肌苷-5′-单磷酸（6-benzylTIMP），其保持与6-meTIMP相似的PPAT抑制效力。结构解析显示6-benzylTIMP进一步重排PPAT疏水口袋残基，导致I422–E436环失去高分辨率密度而变得灵活，表明胶水口袋可容纳更大配体而不降低效力。引入乙基形成6-乙基硫代肌苷-5′-单磷酸（6-etTIMP）后，PPAT抑制效力比6-meTIMP提高约3倍。在ALL细胞中，6-etTIMP显示出比6-meTIMP更好的选择性指数（野生型与ΔNUDT5细胞之间差异更大）。结论：PPAT–NUDT5代谢胶水口袋的构象灵活性可用于改进已临床应用数十年的化疗药物的性质。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，该研究揭示了一类以代谢胶水为中心的调控机制。鉴定出的代谢胶水在营养充足条件下限制嘌呤从头合成，表明胶水机制提供了一种嘌呤感知方式，保护细胞免于代谢资源错误分配。研究因此确立内源性分子胶水可在人类细胞中执行关键调控功能。进一步，临床使用了约70年的硫嘌呤化疗药物作为增强型胶水抑制嘌呤从头合成和细胞生长。药物结合复合物的结构比较揭示了代谢胶水口袋显著的构象灵活性，提示研究代谢控制机制可为发现治疗相关分子胶水提供富有成效的途径。
研究结论（翻译原文"Discussion"末段）：研究人员在此揭示了一种以代谢胶水为中心的新调控机制。这些代谢胶水在营养充足条件下限制嘌呤从头合成，表明胶水机制提供了嘌呤感知的途径，保护细胞免于代谢资源错误分配。研究因此确立了内源性分子胶水可在人类细胞中执行关键调控功能。进一步，已临床使用约70年的硫嘌呤化疗药物作为增强型胶水抑制嘌呤从头合成和细胞生长。药物结合复合物的结构比较揭示了代谢胶水口袋显著的构象灵活性，表明研究代谢控制机制可为发现治疗相关分子胶水提供富有成效的途径。
