用于宿主-病原体相互作用系统级遗传剖析的病毒ORFeome文库

《Cell》：A viral ORFeome library for systems-level genetic dissection of host-pathogen interactions

　　

病毒学研究传统上聚焦于单个病毒或病毒科。DNA合成技术的进步使得大规模构建个体基因产物成为可能，从而能够系统性探索病毒组（virome）。在此，研究人员开发了一个源自513个病毒物种、约12,000个病毒开放阅读框（vORF）的条形码文库，并利用其鉴定了数百个调控细胞增殖、MHC class I抗原呈递和干扰素（IFN）信号的病毒调节因子。跨筛选结果的整合揭示了独特的表型谱和功能vORF模块，从而能够对两个此前未表征的病毒蛋白MC162R和Yaba-like disease virus（YLDV）151R进行深入表征，二者分别损害MHC class I抗原呈递和干扰素（IFN）-β信号。总之，该病毒ORFeome为跨病毒组剖析病毒蛋白功能提供了一个可扩展的框架。

研究背景方面，病毒病原体构成显著的全球威胁，现代连通性使得人畜共患传播迅速扩散，而人类与自然界互动的增加导致人畜共患病毒感染人类的频率上升。人类病毒组跨越26个病毒科，其中20个已知可致人类疾病，疾病谱从急性到慢性感染不等。现有病毒学研究倾向于关注优先病原体或代表性的原型或模型病原体，单个实验室通常研究单一病毒或病毒科，导致许多病毒病原体包括具有潜在关注度的新现病毒及其组成蛋白未被表征。理解这些病毒组分的功能对于识别已进化出足够分子兼容性以实现细胞进入和病毒复制的病毒、并开发对策至关重要，而分子兼容性的关键环节是抑制宿主先天和适应性免疫反应的能力。先前对病毒开放阅读框（vORF）进行遗传筛选的努力主要使用来自单个病毒或病毒科的ORF文库，或计算预测具有特定表型的ORF集合，这些方法未能探测大部分人类致病病毒组，可能成本高昂，且在大多数情况下无法比较进化相关的病毒ORF。基因合成技术的进步使得构建大规模合成基因文库成为可能。

研究人员开发了一个捕获已知人类和动物病毒组多样性的vORF文库，以系统性分析病毒蛋白功能。该文库包含来自513个具有人类嗜性或与人类病毒密切相关的动物病毒的约12,000个vORF（最终约10,000个用于筛选），每个vORF带有独特条形码并克隆至pFuji101载体，通过慢病毒转导至表达反向四环转录激活因子（rtTA）的A375细胞中。研究人员利用该病毒ORFeome鉴定了超过700个调控细胞增殖、MHC class I抗原呈递和干扰素（IFN）信号的病毒调节因子，并对两个未表征蛋白MC162R和YLDV 151R进行了深入表征。该研究发表于《Cell》，构建了可扩展的病毒蛋白功能剖析框架，揭示了病毒蛋白在宿主互作中的多样性机制，对理解病毒免疫逃逸及新现病毒威胁具有重要意义。

主要关键技术方法包括：构建涵盖513个病毒物种约12,000个vORF的条形码文库并克隆至TRE诱导型哺乳动物表达载体；在视网膜色素上皮细胞（RPE1）、人结肠上皮细胞（HCEC）和A375细胞中进行细胞增殖筛选，通过条形码扩增与下一代测序结合MAGeCK分析富集或耗竭的vORF；在A375细胞中进行基于荧光激活细胞分选（FACS）的MHC class I（HLA-A2）表达筛选；利用CRISPR抑制筛选鉴定宿主因子，通过免疫沉淀（IP）、免疫印迹（immunoblot）、荧光显微镜、微尺度热电泳（MST）、BioID邻近标记与质谱分析解析蛋白互作与降解途径；通过定点突变、抑制剂处理验证分子机制；整合多表型筛选结果进行功能模块聚类分析。

研究结果部分保留小标题并简述如下：

Development of a viral ORFeome

研究人员设计了包含513个病毒物种个体蛋白或基因组多蛋白的vORF集合，补充了甲型流感病毒（IAV）等额外毒株及人巨细胞病毒（CMV）核糖体分析鉴定的ORF，针对大于570氨基酸的多蛋白进行分段合成并重叠设计，小vORF串联后通过限制酶切解卷积，最终合成11,821个vORF及777个非病毒ORF，约10,000个解卷积后混合用于筛选。每个vORF片段合成时带独特条形码与可移除终止密码子，克隆至pFuji101载体以支持Gateway重组、T7驱动体外翻译及PLATO核糖体展示、meganuclease位点间灵活转移，条形码通过限制消化多样化（本研究每vORF最多5个）。将vORF文库导入TRE诱导型哺乳动物表达载体并慢病毒转导至表达rtTA的A375细胞，基因组DNA条形码扩增与NGS显示两次独立转导后可检测超过9,000个vORF及超过43,000个独特条形码，中位每个ORF对应5个独特条形码。

Identification of viral ORFs that regulate cellular proliferation

研究人员在RPE1、HCEC和A375细胞中诱导表达病毒ORFeome并传代5–7个群体倍增，收集细胞扩增条形码并测序，用MAGeCK分析条形码丰度以确定特定vORF的富集（GO vORF）或耗竭（STOP vORF）。各显著性阈值下耗减细胞增殖的STOP vORF约为促进增殖的GO vORF的两倍，该现象在三个细胞系各自筛选中重复。STOP vORF较多源于病毒蛋白重编程膜、代谢、转录与复制动力学导致内质网应激、DNA损伤、氧化应激、凋亡等损害增殖存活，同源vORF表型相似。比较各筛选发现各细胞系至少44%的STOP vORF见于多个细胞系，而GO vORF跨细胞系共享比例更低，GO vORF具高度组织特异性，STOP vORF跨细胞类型正相关而GO vORF无此相关性。STOP vORF包括已知毒性蛋白如疱疹病毒UL41宿主关闭蛋白、轮状病毒NSP3，GO vORF包括已知促增殖因子如HIV nef、腺病毒E4-ORF1、HPV E7。

A genetic screen identifies vORFs that regulate MHC class I antigen presentation

研究人员在表达HLA-A2的A375细胞中表达病毒ORFeome，进行基于FACS的HLA-A2表达筛选，为每个vORF设计MHC class I表达评分以根据四个分箱中条形码丰度排序，低评分表明细胞表面MHC class I减少。筛选鉴定了数个已知拮抗MHC class I抗原呈递的病毒蛋白如HIV nef、KSHV K3，以及许多此前未涉及MHC class I下调的候选vORF，将显著vORF映射至序列聚类发现相关vORF降低HLA-A2表面表达，包括已知与未表征拮抗剂，部分vORF增加HLA-A2表面染色如IAV神经氨酸酶vORF。

MC162R is an antagonist of antigen presentation via MHC class I lysosomal degradation

研究人员选定传染性软疣病毒（MCV）未表征蛋白MC162R深入表征，验证其降低表面HLA-A2染色且广泛降低HLA-A、B、C等位基因表面表达，不影响HER2、ERBB3、CD54等无关表面分子，MC162R表达部分保护A375细胞免受识别NY-ESO-1抗原的T细胞杀伤。MC162R表达细胞中HLA-A总蛋白水平下降而转录水平不变，提示促进降解；荧光显微镜观察MC162R与MHC class I邻近，免疫沉淀拉下HLA-A提示可能直接互作。溶酶体抑制剂巴佛洛霉素A1减弱MC162R介导的MHC class I降解，增加LAMP1⁺晚期内体溶酶体区室MHC class I积累，确认经溶酶体途径降解；E1抑制剂TAK-243或26S蛋白酶体抑制剂MG-132处理部分恢复HLA-A2表面染色，提示依赖泛素化 machinery。构建HLA-A2胞质域三联赖氨酸突变体（HLA-A2_TLM）替换潜在泛素化位点赖氨酸为丙氨酸，MC162R不影响其表面表达，表明MC162R促进MHC class I胞质域泛素化以驱动降解。

MC162R exploits multiple E3 ligases to degrade MHC class I

MC162R无直接介导MHC class I泛素化结构域，研究人员进行基于FACS的CRISPR抑制筛选使用泛素相关文库以鉴定MC162R功能所需宿主基因，筛选鉴定出恢复HLA-A2表达的基因包括CUL2^VHLE3连接酶复合物、NEDD4样E3连接酶ITCH、内体分选转运复合体（ESCRT）组分HGS（HRS）、TSG101等。siRNA耗竭与CRISPR突变验证COPA、HGS、ITCH、TSG101、UBAP1、VPS13D突变增加HLA-A2表面染色但未完全恢复，干扰内吞转运基因比单一E3连接酶影响更显著，共免疫沉淀验证MC162R与ITCH、HGS互作。BioID邻近标记质谱分析显示MC162R富集五个胞质NEDD4样E3连接酶家族成员而非核家族如SMURF1/2，突变其他NEDD4样连接酶如WWP1、WWP2轻度增加HLA-A2表面染色，在ITCH突变细胞中额外突变NEDD4、NEDD4L、WWP1、WWP2进一步增加表达，泛HECT连接酶抑制剂heclin抑制MC162R介导的MHC-I下调。MC162R含两个多脯氨酸基序，双突变体丧失诱导HLA-A2丢失能力，体外结合实验显示野生型而非双突变多脯氨酸基序结合ITCH。提出模型：MC162R通过多脯氨酸基序招募NEDD4家族连接酶泛素化MHC class I，经ESCRT machinery内化至多泡体并溶酶体降解，广谱重塑细胞蛋白组成。

Identification of vORFs that regulate IFN signaling

研究人员基于IFN-β/γ处理增加A375细胞表面HLA-A2（ISG）的特性，进行基于FACS的vORF筛选以鉴定拮抗I型（IFN-β）与II型（IFN-γ）IFN信号的病毒蛋白，排除基础MHC class I筛选显著vORF以聚焦IFN特异调节因子。筛选鉴定多数vORF此前未知拮抗IFN信号，包括已知拮抗剂如RABV P、Nipah virus W、Sendai virus C′、HSV-1 ICP22等同源家族vORF，验证19个得分vORF中16个降低IFN-β或IFN-γ介导的HLA-A2诱导，部分影响ISG15 mRNA表达。整合基础、IFN-β、IFN-γ三筛选结果通过MHC表达评分与差异进行聚类，识别多个功能模块如pan-IFN拮抗剂模块、IFN-β特异（痘病毒C4/C10样ORF）与IFN-γ特异（HIV tat）调节因子，lyssavirus P vORF按效力与特异性分入不同模块，显示平行筛选整合的价值。

Yatapoxvirus151R/1L vORFs specifically regulate IFN-β signaling via an IRF9 interaction

Yatapoxvirus属YLDV 151R与YMTV 151R/1L在IFN-β筛选得分，预测为VACV C10L/C16L同源物（痘病毒C4/C10家族抑制Ku70/80依赖DNA感应），但后者未在筛选得分且YLDV 151R等抑制IFN-β介导MHC-I诱导而VACV C4L等无此效，两者均部分抑制DNA感应诱导的IFNB1 mRNA表达但仅YLDV 151R阻断多重ISG诱导且不影响IFN-γ介导IRF1诱导。YLDV 151R不阻断STAT1/STAT2磷酸化或磷酸oSTAT1核转位，质谱显示其与Ku70、Ku80、IRF9互作，增加IRF9水平；结构预测YLDV 151R与VACV C10L/C16L相似含N端（NTD）与C端（CTD）结构域由短连接子连接，YLDV 151R而非VACV C10L/C16L免疫沉淀IRF9，NTD足以完全消除IFN-β信号并与IRF9互作，CTD与Ku70/Ku80互作。YLDV 151R表达破坏静息态IRF9与STAT2互作及IFN-β刺激后ISGF3复合体形成，AlphaFold 3预测YLDV 151R NTD与IRF9 IRF关联域（IAD）互作可能遮蔽STAT2结合位点，定点突变NTD谷氨酸残基E23、E24显示双突变完全缺陷抑制ISG15诱导且共免疫沉淀IRF9能力降低。提出模型：YLDV 151R结合IRF9并阻碍其与基础STAT2及IFN-β诱导的STAT1/STAT2异二聚体互作，阻止完整ISGF3复合体形成及ISG转录。

讨论部分总结：研究人员指出生成病毒ORF文库并用于剖析病毒对宿主通路调控是理解宿主-病毒相互作用的全面系统级方法，传统遗传生化方法常未能捕获病毒组全多样性，其他病毒ORF集合常聚焦预测表型、优先病原体或缺乏多样化条形码等稳健池筛选特征，商业文库昂贵且限于小部分病原体。该病毒ORFeome规模与多样性覆盖已知哺乳动物病毒蛋白质组大部分（初始约12,000个vORF来自>500物种，近期扩展至约13,400个），载体设计通用，能识别同源vORF功能保守或分化并提供进化视角。增殖筛选显示多数vORF具有害活性，反映病毒破坏并劫持细胞过程，且具强细胞类型特异性反映病毒适应多样环境可能与组织嗜性相关，毒性互作代表阻断病毒功能恢复细胞活性的潜在治疗靶点。抗原呈递与IFN刺激研究揭示病毒逃避免疫进化的核心功能：验证许多已知调节因子，发现众多未表征调节因子（多来自未充分研究病毒），序列相似性搜索显示进化相关蛋白共享相似表型，许多蛋白具额外 distinct 活性，病毒蛋白表面进化承担多角色以在有限蛋白质组内最大化功能。MC162R识别多数HLA机制待阐明（作用于质膜/ER膜HLA、识别β2M或HLA共同区域、额外下调SPRY4、CALR、TFRC等意义待定）；鉴定118个候选病毒蛋白特异抑制IFN-β和/或IFN-γ信号，>60个vORF此前未涉及IFN拮抗，聚焦Yatapoxvirus属YLDV 151R与YMTV 151R特异损害IFN-β信号。MC162R与YLDV 151R同属痘病毒科但非正痘病毒属，病毒组范围vORF研究提供从未充分研究物种识别可影响人类蛋白功能病毒基因的机会，这些蛋白可能是表征病毒蛋白同源物但功能分化（如YLDV 151R）或具未知功能（如MC162R），同科病毒可交换遗传物质（重组或重配）将基因从少见病毒转移至人类病原体，动物病毒操纵人类免疫可能构成人畜共患威胁。该文库效用超越单vORF筛选，未来应用包括综合蛋白质组与转录组分析绘制vORF互作组及阐明对细胞生理全局效应以导向病毒-宿主互作系统级理解；尽管有局限（需持续更新、大蛋白合成与慢病毒递送限制、个体蛋白考察错过多蛋白复合体功能、缺乏许多病毒培养或反向遗传学系统、表达水平不代表感染生理），但不减其作为探针对宿主通路与识别操纵细胞过程病毒蛋白的价值。病毒ORFeome是演进资源，标准化灵活设计赋能社区提供功能洞察、促进工具开发与新研究方向以降低实验障碍并推动理解病毒蛋白功能与脆弱性。

研究结论翻译部分：总之，病毒ORFeome文库的生成及其用于剖析病毒对宿主细胞通路的调控代表了理解宿主-病毒相互作用的全面系统级方法。虽然传统遗传与生化方法已产生病毒蛋白功能的关键见解，但它们往往未能捕获病毒组的全部多样性。同样，开发跨病毒组vORF集合的其他努力通常聚焦于具有预测表型的vORF子集、优先考虑感兴趣的子集病原体，或设计时不具备实现稳健通用池遗传筛选的特征（如多样化条形码、简单终止密码子移除用于C端融合、简单亚克隆机制、T7体外翻译）。此外，商业病毒ORF集合因规模应用成本高昂且限于较小子集病毒病原体。该病毒ORF文库的规模与多样性（初始包含来自>500个病毒物种的约12,000个病毒ORF，近期扩展至约13,400个）覆盖了已知哺乳动物病毒蛋白质组的大部分。此规模结合其载体的通用设计使其特别强大，能够通过池遗传筛选识别功能保守或分化的vORF同源物，为其使用识别的基因提供广泛的进化视角。病毒ORFeome包含许多未充分研究物种，使得表征无已知功能或同源性的vORF成为可能。研究人员最初的增殖调节因子筛选显示大多数病毒ORF表现出有害活性，与病毒破坏关键细胞过程同时劫持其为自身目的相一致。显著的是，观察到强细胞类型特异性，反映病毒对多样细胞环境的适应，这也可能与其多样的病毒嗜性相关。例如，HIV主要存在于CD4⁺T细胞，遗传研究显示其复制适合度依赖于CD4⁺T细胞中表达的基因。研究人员注意到每个毒性病毒互作代表阻断病毒功能并恢复正常细胞活性的潜在治疗靶点。研究人员对抗原呈递与IFN刺激的检查揭示了病毒为逃避免疫系统检测而进化的核心功能。若干关键观察出现：首先，鉴定了许多这些通路的先前已知调节因子，验证了高通量筛选方法的稳健性；其次，发现了众多这些通路的此前未表征调节因子，许多来自未充分研究病毒；第三，使用序列相似性搜索证明进化相关蛋白共享相似表型，进一步强化了该文库方法的能力；最后，虽然大多数蛋白注释具特定功能，许多表现出额外的distinct活性。这凸显了病毒蛋白表面进化以执行许多不同角色的观念，在有限蛋白质组内最大化功能。通过减少适应性免疫系统检测实现的免疫逃逸可通过多种机制发生，但许多问题仍存。例如，MC162R似乎识别大多数HLA；仍不清楚其作用于质膜、ER定位HLA或两者；也不清楚其确切如何识别MHC class I，可能通过β2M或不同HLA蛋白的某些共同区域。此外，蛋白质组分析提示额外蛋白可能被MC162R强烈降低，包括SPRY4、CALR和TFRC等，这些关系对病毒功能的意义有待确定。IFN信号作为病毒复制屏障也常被病毒靶向，研究发现118个候选病毒蛋白特异地抑制IFN-β和/或IFN-γ信号，其中>60个vORF此前未涉及IFN拮抗。研究人员聚焦来自相对未表征Yatapoxvirus属的两个痘病毒vORF，YLDV 151R与YMTV 151R均特异地损害IFN-β信号。有趣的是，MC162R与YLDV 151R均属于痘病毒科但位于特征明确的正痘病毒属之外。因此病毒组范围vORF研究为从未达到优先病原体分类但可影响人类蛋白功能的未充分研究物种中识别病毒基因提供了独特机会。这些来自未充分研究物种的病毒蛋白可以是序列和结构同源于表征病毒蛋白但在功能上分化的（如YLDV 151R），或可具先前未知功能的（如MC162R）。这些功能重要是因为同一科内病毒可交换遗传物质（如通过重组或重配），潜在地将基因从较少研究病毒转移至人类病原体。同样，主要在动物中发现但能够操纵人类免疫的病毒可能对人类健康构成人畜共患威胁。该文库的效用超越单vORF功能筛选。未来应用应包括综合蛋白质组与转录组分析以绘制vORF互作组并阐明对细胞生理的全局效应，从而指导走向病毒-宿主相互作用的系统级理解。尽管不完美，标准化灵活的病毒ORFeome资源通过提供功能洞察、促进工具开发及启用新研究方向以破译病毒机制与脆弱性赋能社区，从而降低实验障碍并启动科学家以新方向理解病毒蛋白功能。