综述：已获许可和正在研究的TLR4激动剂作为疫苗佐剂：结构基础、临床进展和未来方向

《Frontiers in Immunology》：Licensed and investigational TLR4 agonists as vaccine adjuvants: structural basis, clinical progress, and future directions

　　

创新疫苗平台的发展，包括蛋白亚单位疫苗和核酸疫苗，已快速推进并为传染病预防建立了新的技术范式。尽管如此，许多下一代疫苗由于抗原复杂性有限而表现出次优的内在免疫原性，导致在无佐剂递送时保护性免疫不足。含铝佐剂，作为最广泛使用的临床佐剂，主要增强体液免疫但引发适度的细胞免疫应答，因此未能满足现代疫苗平台的免疫学需求。此外，标准疫苗常无法在免疫功能低下个体中赋予强大的保护性免疫。因此，下一代疫苗佐剂的理性设计和开发对于扩大创新疫苗的临床转化和增强脆弱人群的免疫原性至关重要。近年来，多种新型佐剂已获得临床批准；其中，Toll样受体4（TLR₄）激动剂是多个已获许可佐剂系统的核心免疫刺激成分，已在多种传染病适应症中展现出强大的免疫调节活性。本综述对当代TLR₄靶向佐剂进行了全面综合，强调其进化发展、分子作用机制和临床转化现状。研究人员旨在为优化现有佐剂和发现新的基于TLR₄的候选佐剂的科学家提供机制性见解和转化指导。

1 引言
疫苗构成全球防御传染病的基础，但传统疫苗平台受限于安全性和免疫原性。减毒活疫苗存在病原体重组和毒力回复风险，灭活疫苗含有复杂成分可引发非特异性免疫。现代基因工程疫苗，如亚单位和核酸平台，克服了这些限制，但因其抗原复杂度低，内在免疫原性欠佳，单独使用常无法诱导强健保护性免疫，需佐剂辅助。目前最广泛使用的含铝佐剂主要增强体液免疫，对Th1型细胞免疫诱导弱，且无法在免疫功能低下个体中激发持久保护。模式识别受体（PRR）中的Toll样受体（TLR）是关键的天然免疫哨兵，TLR₄是唯一能同时激活MyD88和TRIF通路的成员，其双信号能力使其强力刺激适应性免疫的体液和细胞臂。TLR₄的共受体髓系分化蛋白-2（MD-2）为配体工程提供了精确界面。单磷酰脂A（MPL）是临床上最成功的TLR₄激动剂，是获批佐剂系统AS01和AS04的核心成分。此外，新一代合成TLR₄激动剂如葡萄糖吡喃基脂质A（GLA）和第二代脂质佐剂（SLA）在临床前和临床研究中展示出良好安全性和免疫刺激活性。本综述概述TLR₄发现历史，解析配体-受体结合的分子信号级联，系统总结TLR₄佐剂的全球临床开发格局，并深入分析代表性TLR₄激动剂的研究与转化进展，旨在加速更安全有效的新一代TLR₄靶向佐剂的发现和临床转化。

2 TLR₄及其信号传导
2.1 TLR₄
TLR₄的发现源于1980年果蝇Toll基因的鉴定，1996年证实Toll信号在果蝇抗真菌免疫中的关键作用，1997年人类TLR₄被克隆并定义其连接先天和适应性免疫的功能。TLR₄是一种I型跨膜糖蛋白，包含三个进化保守模块：胞外配体结合域（含22个串联富亮氨酸重复序列，折叠成典型马蹄形构象，识别脂多糖[LPS]等配体）、疏水跨膜螺旋（锚定受体并介导配体诱导的二聚化）和胞内Toll/白介素-1受体（TIR）信号域（启动下游信号级联）。TLR₄在树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞等多种先天和适应性免疫细胞上组成性表达。

2.2 TLR₄信号转导
除经典配体LPS外，TLR₄还检测多种病原相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）。LPS进入循环后，与LPS结合蛋白（LBP）形成高亲和力复合物，促进LPS单体递送至单核/巨噬细胞表面；糖基磷脂酰肌醇锚定共受体CD14捕获LPS并呈递给预组装的TLR₄-MD-2复合物。LPS不直接接触TLR₄，而是完全嵌入MD-2的疏水口袋，所形成的MD-2/LPS复合物驱动TLR₄二聚化。因MD-2结合口袋的物种特异性残基，某些配体在鼠TLR₄/MD-2上为激动剂，在人类复合体上则为拮抗剂，提示仅依靠鼠模型预测佐剂在人体疗效需谨慎。TLR₄激活后触发两条下游信号轴：MyD88依赖通路（招募TIRAP/Mal，激活NF-κB和MAPK，驱动促炎细胞因子产生）和TRIF依赖通路（招募TRAM，激活IRF3，促进I型干扰素表达）。MyD88依赖通路中，TIRAP/Mal被招募至TLR₄ TIR域，与MyD88通过同型TIR-TIR结合组装功能复合物，继而招募并磷酸化IRAK4、IRAK1和IRAK2；磷酸化IRAK1与TRAF6结合，触发其寡聚化和E3泛素连接酶活性，激活TAK1复合物；TAK1激活IKK复合物和MAPK家族，导致NF-κB核转位和AP-1活化，上调促炎细胞因子、趋化因子和共刺激分子基因。TRIF依赖通路中，TRIF招募TRAF3，与TBK1和IKK?互作，磷酸化IRF3；IRF3同源二聚化并入核，驱动I型干扰素转录。MyD88驱动的促炎基因转录和TRIF依赖的I型干扰素诱导协同刺激TNF-α、IL-6和IL-1β等关键细胞因子产生，这些可溶性介质在注射部位和引流淋巴结发挥趋化活性，募集单核细胞、中性粒细胞和未成熟树突状细胞至局部炎症环境，促进其表型和功能成熟。成熟抗原呈递细胞高效摄取处理抗原，上调MHC I/II类分子和共刺激配体（CD80、CD86、CD40），分泌免疫调节细胞因子，从而有效启动na?ve抗原特异性CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞，并驱动抗原特异性B细胞分化为高亲和力抗体分泌浆细胞和长寿命记忆B细胞，最终诱导强健、持久且平衡的细胞和体液保护性免疫。

2.3 TLR₄介导的疫苗诱导适应性免疫增强
TLR₄激活直接补偿重组蛋白和亚单位疫苗的固有弱点（无法提供完全DC激活和Th1极化所需的先天信号），通过三种互补机制：第一，TLR₄激活DC强效上调共刺激分子，并通过TRIF通路促进外源抗原在MHC I类分子上的交叉呈递，这对启动CD8⁺CTL至关重要；第二，双MyD88-TRIF信号轴通过协调细胞因子诱导驱动Th1极化：MyD88依赖通路产生关键Th1极化细胞因子IL-12，TRIF依赖通路介导I型干扰素表达进而促进交叉呈递；第三，TLR₄信号可直接作用抗原特异性B细胞，B细胞内在MyD88信号对于生发中心反应和早期IgG产生是必需的。在疟疾疫苗研究中，与Nanoalum佐剂相比，GLA佐剂联合保护性疟原虫富含半胱氨酸抗原在小鼠中诱导了更高的抗体滴度、免疫荧光血清转换率和体外寄生虫生长抑制活性；在兔中，GLA-SE制剂诱导了最高的寄生虫生长抑制抗体滴度。此外，当与其他类型激动剂组合时，TLR₄可发挥更强免疫刺激功能；含MPL和TLR7激动剂R837的纳米颗粒使小鼠生发中心B细胞数量增加5倍以上，显著增强抗体亲和力。

3 TLR₄激动剂
脂多糖（LPS）是TLR₄的经典天然配体，为革兰阴性菌外膜组分，结构上包含疏水脂质A、亲水核心寡糖和高变O抗原多糖三个共价连接域。脂质A是LPS锚定域，进化最保守，是与TLR₄-MD-2复合物特异性结合和激活受体所需的最小结构基序。LPS在皮摩尔至纳摩尔浓度即可激活多数先天免疫细胞，但具有强内毒素性。目前开发中的TLR₄激动剂主要分为糖脂和非糖脂两类。

3.1 单磷酰脂A（MPL）
自20世纪70年代起，为利用LPS免疫刺激特性并降低毒性，Ribi等人开发了以明尼苏达沙门菌R595为原料的水解工艺：发酵细菌细胞经沉淀、洗涤、酸水解和碱水解，得到含4、5或6条酰基链和单个磷酸基团的脂质A衍生物混合物，即3-O-脱酰基单磷酰脂A（3D-MPL），通常简称为MPL。MPL在极低浓度下激活多数先天免疫细胞，在老年小鼠中与抗原共施用可诱导与年轻小鼠相当的抗体滴度。MPL的内毒素活性仅为天然LPS的0.08%，机制上此减毒与MPL优先激活TRIF依赖通路有关；与天然LPS不同，MPL诱导的免疫应答不伴随caspase-1激活和IL-1β分泌，而与IL-10等抗炎细胞因子产生相关，防止过度系统性炎症反应。MPL水溶性极低，需定制制剂策略最大化体内免疫刺激功效并降低不良反应风险。葛兰素史克开发了系列含MPL的递送系统：AS01（脂质体，含MPL和QS-21）、AS02（水包油乳剂，含MPL和QS-21）、AS04（铝盐吸附MPL）和AS15（脂质体，含MPL、QS-21和CpG ODN）。AS01和AS04已获全球监管批准用于许可人用疫苗。

3.1.1 佐剂系统01（AS01）
AS01是含两种免疫刺激成分（MPL和QS-21）的脂质体制剂，有AS01_B（每剂50 μg MPL + 50 μg QS-21）和AS01_E（每剂各25 μg）两种剂量形式。QS-21是从皂树皮中纯化的三萜皂苷，具有剂量依赖性溶血活性，需与胆固醇共制剂并嵌入脂质体以消除此副作用。脂质体双层膜包裹疏水性MPL，限制其与血液中LBP和可溶性CD14的直接相互作用，降低非特异性系统性单核/巨噬细胞激活风险。QS-21激活被膜下窦巨噬细胞中的caspase-1，触发炎症小体组装和下游促炎细胞因子成熟分泌。非人灵长类研究显示，单独MPL或QS-21均不能诱导早期IFN-γ反应或激活淋巴结驻留NK细胞和天然CD8⁺T细胞；这些先天事件需要AS01中两种成分的协同递送，这对产生高频多功能CD4⁺T细胞反应至关重要。近期研究显示AS01给药诱导单核和树突状细胞亚群表观遗传修饰，改变AP-1、GATA结合蛋白、C/EBP家族成员和干扰素调节因子等关键免疫转录因子的染色质可及性。AS01已纳入多个许可人用疫苗，最著名的是疟疾疫苗Mosquirix（RTS,S抗原，三剂初免和第四剂加强后对5-17月龄儿童保护效力分别为28.3%和36.3%）、带状疱疹疫苗Shingrix（截短水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原，≥50岁成人保护效力97.2%，≥70岁为91.3%）和呼吸道合胞病毒疫苗Arexvy（RSV融合糖蛋白preF3抗原，≥60岁参与者将RSV相关下呼吸道疾病风险降低82.6%）。AS01还与结核病疫苗M72/AS01等候选疫苗正在临床开发中。值得注意的是，AS01相关局部和全身不良事件频率和严重程度高于含铝佐剂，如Arexvy试验中AS01组注射部位疼痛（60.9% vs 9.3%）、疲劳（33.6% vs 16.1%）等发生率显著升高。

3.1.2 佐剂系统04（AS04）
AS04由MPL吸附于磷酸铝制成。含铝佐剂通过抗原储库形成和先天免疫细胞直接免疫刺激增强体液免疫。在鼠模型中，AS04诱导的抗原特异性IgG滴度比单独MPL高4-8倍，同时将促炎细胞因子产生限制于注射部位和引流淋巴结。临床数据显示，与单独铝相比，MPL吸附于磷酸铝诱导快速局部细胞因子表达、促进强效APC激活，并引发显著更高和更持久的抗原特异性抗体反应。AS04已纳入两种许可人用疫苗：乙肝疫苗Fendrix（用于肾功能不全患者，接种后36月80.4%患者抗-HBs滴度≥10 mIU/ml，而标准乙肝疫苗为51.3%）和二价HPV疫苗Cervarix（预防HPV16/18所致疾病，对HPV-16/18相关CIN2+和原位腺癌保护效力92.9%）。此外，HSV-2疫苗和EBV gp350/AS04疫苗的临床试验也展示了AS04的功效。

3.1.3 佐剂系统02（AS02）
AS02是含MPL和QS-21的水包油乳剂，通过抗原储库形成和局部免疫微环境调节双重机制驱动先天和适应性免疫。在RTS,S疟疾疫苗II期临床试验中，RTS,S/AS02在8、12、16周龄婴儿中，接种后12和18个月对多次临床疟疾发作的保护效力分别为50.7%和26.7%。AS02也用于其他处于不同临床阶段的HPV和HIV候选疫苗。

3.1.4 佐剂系统15（AS15）
AS15是基于脂质体的制剂，含MPL、QS-21和CpG ODN三种免疫刺激成分。CpG ODN是含非甲基化CpG基序的合成寡脱氧核苷酸，结合TLR9，触发炎症信号，促进抗原特异性抗体和CD8⁺CTL生成。AS15已纳入多种癌症候选疫苗，如重组黑色素瘤相关抗原3（MAGE-A3）疫苗用于治疗黑色素瘤等恶性肿瘤。但两项III期临床试验显示，AS15佐剂的MAGE-A3疫苗作为手术切除后辅助治疗未能改善黑色素瘤或非小细胞肺癌患者的总生存期或无病生存期。

3.2 细菌酶组合化学（BECC）
2013年提出的BECC平台通过基因工程改造细菌脂质A生物合成酶（酰基转移酶、脱酰酶、磷酸酶、糖基转移酶），生成免疫刺激效力增强且毒性降低的佐剂。代表性候选物BECC438和BECC470在鼠疫耶尔森菌中重组生产，结构上含两个磷酸基团和独特酰基链长度。相比GLA，BECC化合物激活NF-κB信号和诱导细胞因子的效力显著更强。在鼠疫疫苗研究中，BECC438联合rF1-V抗原诱导的IgG水平显著高于GLA；在流感疫苗研究中，BECC470联合血凝素抗原对12月龄小鼠提供完全保护，且免疫反应强于BECC438或GLA。但BECC438和BECC470尚未进入临床试验。

3.3 从头合成的MPL类似物
来自细菌水解的MPL是混合物，批次间差异大，而从头合成可精确控制反应，降低污染风险。多种从头合成脂质A类似物已进入临床前和临床开发。

3.3.1 葡萄糖吡喃基脂质A（GLA）
GLA由Avanti公司开发，含二糖骨架、一个磷酸基团和六条14碳酰基链，与MPL结构差异主要在酰基链数目、连接位置和长度。GLA免疫刺激效力强于MPL，在小鼠模型中诱导高于LPS或MPL的抗体滴度，并激发强效1型T细胞反应。GLA已被配制成多种佐剂制剂：水包油乳剂GLA-SE、水溶液制剂GLA-AF和含QS-21的脂质体制剂GLA-LSQ。GLA-SE单独使用（无需额外免疫刺激剂）已在疟疾、结核病、血吸虫病、麻风病、HIV、RSV、流感和生殖器疱疹等多种疫苗中诱导保护性免疫；GLA-AF增强皮内接种的免疫反应；GLA-LSQ用于疟疾候选疫苗。

3.3.2 第二代脂质佐剂（SLA）
基于蛋白结构测定和分子对接，研究人员根据配体-受体结合原理优化GLA。GLA的六条酰基链中有两条过长，导致其结合TLR₄-MD-2疏水口袋但未达到最佳构象拟合。移除这两条酰基链各一个乙基得到SLA，其具有更大的疏水表面和更高结合亲和力，TLR₄结合和激活能力优于GLA。在鼠带状疱疹疫苗研究中，SLA-SE与Shingrix比较：在年轻小鼠中，gE/SLA-SE诱导的gE特异性体液和细胞免疫反应与Shingrix相当；在老年小鼠中，gE/SLA-SE诱导更强的gE特异性细胞免疫。SLA在传染病预防和癌症治疗中均显示出显著疗效。

3.3.3 E6020
E6020是由Eisai公司开发的全合成非糖脂TLR₄激动剂，结构上无二糖骨架，含两个磷酸基团和六条酰基链。与含铝佐剂相比，最佳剂量的E6020使抗体峰值水平增加2倍；与MF59乳剂共制剂可显著提高抗体滴度。E6020提高抗体滴度并促进抗体同种型转换。在巨细胞病毒疫苗开发中，研究者将QS-21和E6020共包封于含胆固醇脂质体中制成SAP14佐剂，该佐剂耐受性好，在小鼠和非人灵长类中诱导与AS01_B相当的持久中和抗体反应。E6020也用于锥虫等病原体疫苗开发。

4 展望
TLR₄激动剂作为疫苗佐剂的临床价值已通过MPL的成功转化得到确认。全球研究产生了多种TLR₄激动剂开发策略，包括天然脂质A结构修饰、细菌基因组工程、基于结构的从头合成和通过高通量筛选及计算机辅助药物设计发现小分子激动剂。制剂技术（脂质体、水包油乳剂、纳米悬浮液）通过提高体内递送效率和稳定性，克服了TLR₄激动剂水溶性差、生物利用度有限和反应原性高等固有局限，显著扩展了转化潜力。积累的临床试验数据表明，大多数新一代TLR₄激动剂具有改善的免疫刺激效力和良好的安全性。然而，临床转化仍面临挑战：第一，免疫刺激与系统性反应原性之间的治疗窗仍然狭窄；MyD88驱动的前炎细胞因子生产导致不良反应，但反应原性也受TRIF信号、制剂成分和宿主因素调节；TRIF偏向性激动剂设计和注射部位限制性制剂在临床前显示出希望，但大多数候选物仍缺乏强有力的临床证据。第二，TLR₄激动剂与非蛋白疫苗平台（mRNA、DNA、病毒载体）的兼容性尚不明确；这些平台具有不同的先天激活特征，可能不以相同方式受益于TLR₄共刺激。第三，制造挑战持续存在：MPL是异质性混合物，批次间变异大；从头合成的GLA和SLA均一性更好但涉及复杂多步合成，限制了可扩展性。通过激动剂设计、制剂优化和制造技术的持续进步来解决这些挑战，将扩展TLR₄靶向佐剂在疫苗领域中的临床实用性。