《Frontiers in Neuroscience》：Advances in biomarkers for diagnosing and prognosticating disorders of consciousness
由脑损伤引起的意识障碍（DoC）包括一系列临床综合征，其损害程度因病变位置、病因、严重程度和个体患者因素而异。这些差异显著影响康复策略和长期预后。目前的诊断评估主要依赖于行为量表，并辅以电生理学和神经影像学研究；然而，这些方法在客观性、敏感性和可及性方面仍有限。因此，临床上需要具有生物学信息的生物标志物，以提高DoC的诊断精确性和预后分层能力。本叙述性综述综合了生物标志物研究的最新进展，涵盖了蛋白质组学、代谢组学和微小RNA（miRNAs）特征，涉及多种生物标本。研究人员评估了从探索阶段到验证阶段的研究发现，并讨论了其转化潜力，为未来大规模、多中心研究提供有价值的参考。
**1 引言**
意识起源于脑干和皮层下觉醒系统与丘脑皮层及皮层-皮层认知网络的整合活动。这种整合使得个体能够感知、综合和解释内部状态及外部环境，并通过意志行为、语言和目标导向行动表达。意识障碍（DoC）以环境意识和反应性的严重损害为特征，临床上表现为持续、选择性和整合性意识能力的显著破坏，同时伴有明显减弱或不一致的反应性。DoC通常由获得性脑损伤引起，常见病因包括创伤性脑损伤（TBI）、缺氧缺血性脑损伤（HIBI）和脑血管事件。TBI是DoC的主要病因。严重创伤导致脑组织不可逆的结构损伤，损害大脑皮层和脑干内的上行网状激活系统，从而破坏支持意识的神经回路的结构完整性和功能连接，最终导致意识水平的持续抑制。慢性DoC患者的长期护理需求给家庭和医疗系统带来了沉重的社会经济负担，使DoC成为一个重要的公共卫生挑战。DoC的主要诊断类别包括植物状态（VS），也称为无反应觉醒综合征（UWS），以及微意识状态（MCS）。随着研究的进展，MCS被进一步细分为MCS+和MCS?，分别根据是否存在可辨别的语言相关行为来区分。MCS+的特征是遵循指令、可理解的言语或有意图的沟通，因此这种亚型划分对于诊断分层和长期预后评估具有重要的临床意义。当患者恢复一致的功能性沟通或物体使用时，他们被归类为从微意识状态中脱离（EMCS）。此外，研究还识别出一个表现出认知运动分离（CMD）的患者亚群，这是一种新型的分离现象，其特征是在没有明显行为输出的情况下，对指令产生可重复的神经反应。关键在于，这些诊断实体之间的预后存在显著差异，MCS的结局明显优于VS/UWS。因此，准确且早期地对具体的意识障碍水平进行鉴别诊断至关重要。它为预后分层提供信息，指导选择有针对性的治疗和康复干预措施，并塑造临床管理路径。
在DoC患者的临床诊断中，昏迷恢复量表修订版（CRS-R）仍是临床上唯一推荐的诊断金标准。虽然它提供了患者意识水平的初步评估，但该量表固有的主观性带来了显著局限性。单次CRS-R评估往往无法捕捉患者意识状态的波动性，其结果易受评估者经验和患者觉醒与注意力的自发波动影响。因此，客观测量方法如脑电图（EEG）和功能性磁共振成像（fMRI）被常规用作补充工具，以佐证主观行为量表的结果。然而，这些神经影像学和电生理技术也存在局限性，包括操作复杂性、采集时间长、成本高以及对于有金属植入物的患者存在禁忌。最近，源自患者生物体液和其他生物标本的生物标志物的发展已成为神经系统疾病研究的前沿领域。基于血液的生物标志物在脑损伤评估中的临床相关性日益增加。美国外科医师学会（2024）的《创伤性脑损伤最佳实践指南》讨论了血液生物标志物，包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、泛素C端水解酶L1（UCH-L1）和S100钙结合蛋白β（S100B），作为影像学决策和TBI后结局预测的辅助工具。此外，美国食品药品监督管理局已批准测量GFAP和UCH-L1的血液检测，用于评估疑似轻度TBI的成人，主要目的是帮助排除计算机断层扫描（CT）可检测的急性颅内病变，并减少不必要的CT影像检查。最近的建议进一步支持将血液生物标志物纳入急性TBI的特征描述、风险分层、预后评估和研究分类框架。这些进展为在严重脑损伤和DoC中探索血液生物标志物提供了重要的转化基础。然而，由于大多数指南支持的应用源自急性TBI队列，特别是轻至中度TBI人群，它们在长期意识障碍（pDoC）和非创伤性病因中的诊断和预后价值需要进一步的前瞻性验证。更广泛地说，基于生物体液的生物标志物可能提供客观、可及且具有机制信息的数据，以补充DoC中的行为、神经影像学和电生理学评估。尽管取得了这些进展，但专门针对DoC整合多种生物样本类型结果的全面综述仍然很少。先前的综述通常集中于单一生物标志物类别、有限的生物标本来源或更广泛的TBI相关生物标志物证据，包括血液/脑脊液（CSF）生物标志物、唾液miRNAs和损伤相关分子标志物。因此，对中枢、外周和肠道生物标本来源的整合性综述可能有助于阐明DoC生物标志物研究的当前证据格局和转化鸿沟。
本综述旨在总结DoC中多种生物标本来源的当前生物标志物证据，包括外周血、CSF、粪便、尿液和唾液。为了超越对单个生物标志物的简单编录，研究人员采用了一个以DoC为导向的“中枢–外周–肠道”框架，将中枢神经系统损伤、外周炎症和代谢反应以及肠脑轴相关改变与诊断、预后和转化中的关键临床挑战联系起来。研究人员重点关注主要的生物标志物类别，包括蛋白质、代谢物和微小RNA（miRNAs），并讨论它们在诊断、预后、机制和转化方面的相关性。因此，本综述围绕四个互补领域组织：外周血用于可及性生物标志物评估，CSF用于中枢神经系统相关信息，肠脑轴（GBA）用于肠道和系统性相互作用，以及非侵入性样本用于可行的纵向监测。在每个领域内，讨论了代表性生物标志物和当前证据的局限性，为未来DoC的生物标志物验证和转化研究提供参考（图1）。
**1.1 文献检索与筛选策略**
本文旨在作为一篇叙述性综述，总结用于DoC诊断和预后的生物体液及生物标本生物标志物的证据。为了支持叙述性综合，研究人员在PubMed、Web of Science、CNKI和万方数据库中进行了针对性文献检索，时间范围从数据库建库至修订稿准备之时。检索策略结合了适当的主标题和与DoC、脑损伤、生物样本类型和生物标志物类别相关的自由文本关键词。主要检索词包括“意识障碍”、“DoC”、“长期意识障碍”、“pDoC”、“植物状态”、“无反应觉醒综合征”、“微意识状态”、“MCS”、“创伤性脑损伤”、“缺氧缺血性脑损伤”、“生物标志物”、“血清”、“血浆”、“血液”、“脑脊液”、“粪便”、“尿液”、“唾液”、“蛋白质组学”、“代谢组学”、“microRNA”、“miRNA”、“肠道微生物群”和“肠脑轴”。详细的检索词和数据库特定的检索组合见补充表S1。
数据库检索共识别出10,600条记录，包括来自Web of Science的6,416条、PubMed的2,843条、万方数据的852条和CNKI的489条。在手动移除5,982条重复记录后，根据标题和摘要筛选了4,618条记录。其中，4,469条因与综述主题无关、未报告生物标志物数据或代表重叠数据集而被排除。共查找了149篇报告的全文，其中74篇无法获取。这些未检索到的报告主要包括通过机构访问或公共数据库无法获得全文的记录、没有可获取全文的会议摘要，或书目信息不足以检索的出版物。由于这些报告无法详细评估，它们未被纳入核心叙述性综合，这可能引入一定程度的选择偏倚。因此，本叙述性综述的结论应结合此局限性进行解读。其余75篇全文报告进行了合格性评估，45篇被排除，原因包括仅关注影像学、电生理学、行为评估或康复干预而无生物标本生物标志物数据；为摘要、信件或指南而无原始生物标志物数据；或缺乏足以进行解读的研究数据。最终，30篇报告被纳入叙述性综合。
研究选择由两位作者进行。首先由两位作者根据预定的纳入和排除标准独立筛选标题和摘要。然后由同两位作者对潜在相关报告进行全文级别评估。在标题/摘要筛选或全文评估过程中出现的分歧通过讨论解决，若无法达成共识，则咨询第三位作者。
文章被考虑纳入的条件包括：（1）涉及DoC、pDoC、VS/UWS、MCS、EMCS或与DoC生物标志物研究相关的脑损伤人群；（2）研究了源自血液、CSF、粪便、尿液、唾液或其他生物标本的生物标志物；（3）报告了诊断、预后、病因、病理生理或转化相关性；（4）为脑损伤和DoC的生物标志物研究提供了方法学、机制、指南基础或转化背景。文章被排除的一般情况包括：（1）与DoC、脑损伤或生物标志物研究无关；（2）仅关注神经影像学、电生理学、行为评估或康复干预而无生物标志物数据；（3）不涉及血液、CSF、粪便、尿液、唾液或其他基于生物标本的生物标志物；（4）缺乏足够的方法学细节、人群信息或结局数据以支持解读；（5）为重复发表或重叠数据集，此时保留最完整或最相关的报告；（6）为无全文的会议摘要、社论、信件、新闻文章或没有原始数据的评论。综述、指南、共识声明和方法学文章仅在提供背景信息、临床指导或方法学背景时使用，不被视为核心生物标志物证据。
在讨论诊断或预后生物标志物性能时，优先考虑原始研究。正文、图和总结表中讨论的文章是根据与主题的相关性、研究设计、证据对DoC的直接性、生物标志物类型、验证状态以及对本综述多隔室生物标志物框架的贡献进行选择的。文献识别和筛选过程总结于图2，而叙述性综合的概念框架见补充图S2。
**2 外周血生物标志物**
作为最容易获取、微创且可重复获得的生物标本，外周血（特别是血浆或血清）在DoC生物标志物研究中占据关键地位。外周血中的分子成分，包括蛋白质、代谢物和循环miRNAs，可以作为中枢神经系统（CNS）病理生理学的反映指标。鉴于TBI是DoC的主要病因，在TBI血液生物标志物研究中建立的坚实临床证据基础为DoC生物标志物的跨病因学研究提供了有力支持。由于许多血液生物标志物最初是在急性TBI队列中识别或验证的，它们与pDoC的相关性应根据病因、疾病阶段、采样时间和验证背景进行解读。在没有专门队列验证的情况下，直接外推至缺氧缺血性、卒中相关或混合病因的DoC仍然不合适。本分析围绕三个核心分子领域构建：蛋白质组学、代谢组学和miRNA分析，如图3所示。在这些领域中，证据基础范围从相对较为成熟的蛋白质检测到更探索性的代谢组学和miRNA特征，后者需要进一步验证。总体而言，这些生物标志物——通过反映或与关键病理过程如神经炎症、轴突损伤、代谢紊乱和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能障碍相关联——有助于诊断分层、预后预测和病因学鉴别。
**2.1 外周血蛋白生物标志物**
外周血蛋白生物标志物为DoC的分子评估提供了临床上最易获取的方法之一。然而，它们的转化相关性需要谨慎解读，因为许多最初在TBI中研究的循环蛋白主要反映的是总体脑损伤负担，而非意识障碍本身。这些标志物在生物学上与DoC相关，但其特异性取决于它们是否捕获了组织水平的损伤、系统性反应，或与意识相关网络功能障碍更直接相关的机制。从机制角度看，外周血蛋白生物标志物可分为三大类。首先，结构性神经损伤标志物，包括神经丝轻链（NfL）、tau蛋白、UCH-L1和神经元特异性烯醇化酶（NSE），主要反映轴突或神经元损伤。其次，胶质细胞和血脑屏障相关标志物，如GFAP和S100B，表明星形胶质细胞激活、胶质损伤或屏障破坏。第三，炎症和内分泌相关标志物，包括白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-13（IL-13）、调节激活正常T细胞表达和分泌因子（RANTES）和促肾上腺皮质激素（ACTH），可能反映继发性炎症激活、系统性应激反应或恢复相关的神经内分泌调节。这种机制分类很重要，因为这些过程可能通过破坏长程神经连接、继发性神经炎症、血脑屏障功能障碍、改变突触环境和系统性应激反应来影响意识相关生物学。然而，它们不一定能将意识障碍与脑损伤的更广泛后果区分开来。
在目前可用的候选标志物中，NfL似乎与pDoC分层具有最直接的相关性。据报道，血清NfL在损伤后1-3个月和6个月时在pDoC患者中仍保持升高，并与意识水平相关，包括早期UWS患者水平高于MCS，以及与病因相关，后期HIBI患者水平高于TBI。这些发现表明，NfL可能反映pDoC中持续的轴突退行性变和疾病阶段相关的损伤负担。然而，NfL对意识障碍是否具有特异性，而非对持续性轴突损伤，仍有待确定。
其他神经元和胶质细胞损伤标志物提供了支持性但DoC特异性较低的信息。通过生物芯片阵列技术检测发现，即使经过2个月的休息期，重复头部创伤个体的NSE仍显著升高，表明独立于胶质病理的持续性神经元损伤。GFAP和UCH-L1在TBI研究中的转化基础比在DoC特异性验证中更为坚实。GFAP是一种星形胶质细胞特异性胶质标志物，在定量血清酶联免疫吸附试验（ELISA）研究中显示，与S100B相比，对区分创伤性颅内病变具有更高的诊断特异性。它还可能有助于表征星形胶质细胞损伤、血脑屏障破坏和白质微结构损伤，因为使用超灵敏单分子阵列（Simoa）技术测量的血清GFAP水平与神经影像上的白质高信号体积和各向异性分数相关。相比之下，S100B在TBI早期上调，但可能因颅外损伤或肝功能障碍而混淆，限制了其疾病特异性。UCH-L1可能提供关于神经元损伤的补充信息；基于ELISA的研究在严重TBI患者的血清和CSF中检测到UCH-L1水平升高，且水平与损伤严重程度和死亡率相关。然而，目前这些标志物应主要被解读为脑损伤相关而非DoC特异性生物标志物。它们未来的价值可能在于与NfL、炎症介质以及临床或神经生理变量的组合，而非单独诊断。
炎症相关蛋白也具有预后价值，但其生物学非特异性限制了其解读。严重TBI后，外周血中的IL-6、TNF-α和RANTES显著上调。动物模型描述了TNF-α和IL-6的时空动态，而前瞻性人体研究表明血浆RANTES与早期死亡率相关。在pDoC队列中，IL-13和TNF-α与CRS-R评分和长期功能恢复相关，表明可能在预后分层中具有潜在作用。然而，细胞因子和趋化因子受感染、系统性炎症、药物暴露、营养状态和合并症的影响很大。同样，ACTH可能反映下丘脑-垂体-肾上腺轴活动，但其与意识恢复的直接关系仍不确定。
尽管取得了这些进展，该领域仍然存在关键差距。大多数研究规模较小且存在显著的方法学异质性。首先，检测灵敏度的差异可能导致研究中生物标志物浓度的报告不一致。传统的ELISA检测通常比超灵敏的Simoa平台具有更低的检测灵敏度，后者能够检测pg/mL水平如NfL这样的低丰度蛋白。其次，非标准化的采样时间线，在损伤后不同时间间隔采集血液，可能混淆蛋白水平与临床结局之间的关联。第三，蛋白表达可能受颅外损伤或肝病等混杂因素的影响，进一步使跨研究比较复杂化。总体而言，外周血蛋白生物标志物不应被视为具有同等转化成熟度的同质群体。当前证据表明，NfL是pDoC相关分层中最直接支持的循环标志物之一，而GFAP和UCH-L1更适合作为脑损伤相关标志物，具有潜在但尚未证实的DoC特异性价值。炎症细胞因子可能补充预后评估，而NSE、S100B、RANTES和ACTH仍为支持性或依赖背景的候选标志物。未来研究应包括不伴有持续性DoC的脑损伤对照组，按病因和意识表型对患者进行分层，并评估蛋白组合在已建立的行为学、电生理学、神经影像学和临床预后评估之外的增量诊断或预后价值。
**2.2 外周血代谢物生物标志物**
除了主要反映神经损伤和炎症反应的蛋白生物标志物外，血液代谢组学提供了DoC患者系统性代谢扰动的全面视角。通过分析小分子代谢物，该方法能够捕获蛋白质标志物未完全揭示的脂质、氨基酸和嘌呤代谢变化，从而为DoC的病因分层、意识水平区分和预后预测提供补充信息。当前的血清代谢组学研究表明，DoC中的代谢紊乱并非局限于单一代谢通路，而是涉及多个反复出现的生物学主题。使用超高效液相色谱-四极杆-Orbitrap高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）的研究报告了TBI诱导的DoC中氨基酸和脂质代谢的改变，包括跨10个核心代谢通路的53种差异代谢物。类似地，一项非靶向超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）分析根据24种差异血清代谢物区分了UWS与MCS患者，其中MCS患者中溶血磷脂如LysoSM (18:1)和LysoPC (18:1) 增加，而脱氧胆酸3-葡萄糖苷酸减少。由DG (34:1)、PE (18:1) 和异丙隆组成的血清组合在区分UWS与MCS时达到了0.94的受试者工作特征曲线下面积（AUC）。这些发现表明血清代谢物可能捕获与意识水平相关的生物学差异。然而，由于此性能源自同一数据集内的内部验证，它应被解读为产生假设而非临床准备就绪的证据。
靶向代谢组学通过专注于具有更高分析特异性的预设代谢通路提供了一种补充策略。Yu等人报告了DoC中21条代谢通路的异常，其中嘌呤代谢受到最显著的抑制。减少的腺苷衍生物和升高的磷脂酰胆碱(38:5)-H（PC (38:5)-H）以及花生四烯酸有助于区分UWS与MCS，并与CRS-R评分正相关。这些发现表明预设的代谢通路可能为区分DoC中的意识水平提供有用的分层信号。然而，这些代谢变化是否特异性地反映了意识障碍本身，而非脑损伤、全身性疾病或长期制动带来的更广泛后果，仍不确定，需要在适当对照的队列中进行验证。
从机制上讲，所报告的血清代谢变化可能反映与DoC相关的几种生物学过程。脂质和甘油磷脂紊乱可能表明严重脑损伤后的膜重塑、髓鞘或轴突损伤、线粒体功能障碍和炎症性脂质信号传导。抑制的嘌呤代谢可能与受损的ATP转换、改变的腺苷信号传导以及减少的能量依赖性突触活动有关，这在生物学上与睡眠-觉醒调节和觉醒调节相关。氨基酸代谢变化可能进一步反映神经递质失衡、谷氨酸相关的兴奋毒性应激或能量底物利用改变。这些通路提供了系统性代谢紊乱与意识障碍之间的生物学合理联系。然而，它们在DoC病理生理学中的作用仍不确定，因为它们可能要么促成疾病机制，要么反映继发性损伤相关的代谢反应。需要通过配对血清-CSF和纵向多模态分析进行进一步验证。
近期研究进一步探讨了特定血清代谢指标和谱图是否在不同病因和预后亚组中存在差异。Huang等人报告，总胆红素（TBIL），一种具有抗氧化和抗炎特性的常规生化指标，与DoC患者的预后正相关，表明临床可及的代谢标志物可能具有辅助预后价值。此外，Ge等人使用基于液相色谱-质谱联用（LC–MS）的非靶向代谢组学表征了跨病因、意识水平和预后的血清代谢谱。他们的发现表明，创伤性DoC中的几种甘油磷脂水平低于非创伤性DoC，不同意识水平存在不同的能量代谢模式，以及与预后相关的改变，如结局良好的患者中LysoPE (18:0/0:0)水平降低。这些发现表明血清代谢谱可能有助于识别DoC中病因学和预后相关的亚组，但其DoC特异性和在已建立的多模态评估之外的增量价值仍有待确定。
从转化角度来看，外周血代谢组学主要仍处于发现阶段。非靶向平台在代谢物覆盖范围、灵敏度、鉴定置信度和定量精度方面存在差异。例如，Wang等人使用UPLC-MS/MS鉴定了区分UWS与MCS的血清代谢物，而Feng等人采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS表征了TBI诱导DoC中的脂质和氨基酸代谢物，这在一定程度上可能解释核心生物标志物筛选中的不一致性。此外，不同研究中的血清离心条件不同，有些使用1,500 rpm离心15分钟，其他使用3,000 rpm离心10分钟，这可能导致测量到的代谢物浓度出现变异。结合样品处理、储存、冻融循环、数据处理流程、标准化策略和统计阈值方面的差异，这些方法学变异仍然是开发统一且可重复的DoC血清代谢组学特征的主要障碍。因此，高性能的代谢物组合目前应被视为产生假设而非临床已确立的。它们的临床价值需要标准化工作流程、外部验证以及证明在已有评估之外的增量价值。
**2.3 外周血microRNA生物标志物**
除了描绘下游系统性变化的代谢组学分析外，循环miRNAs作为基因表达的关键调控因子，可能将上游分子通路（如凋亡和神经炎症）与DoC的临床表型联系起来。由于它们在循环中相对稳定且具有潜在的组织特异性，miRNA生物标志物可能通过反映脑损伤的病因异质性和时间动态来补充代谢和蛋白质标志物，从而丰富DoC评估的多模态生物标志物组合。然而，它们的转化价值不应被高估。循环miRNA的变化可能源自多种细胞来源，包括受损的神经组织、免疫细胞、内皮细胞、血小板和其他外周组织。因此，改变的循环miRNA信号应被解读为可能与脑损伤和恢复相关的系统性调控特征，而非意识障碍的直接证据。
由于DoC中直接的miRNA证据仍然有限，来自TBI研究的方法学经验为DoC研究提供了重要起点，同时也突显了几个直接影响临床转化的障碍。早期研究建立了茎环定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）作为灵敏miRNA检测的主要方法。后续工作引入了纵向采样、TaqMan低密度阵列（TLDA）、数字聚合酶链反应（dPCR）和计算机通路分析，以改进时间谱分析、定量精度和生物学解读。然而，缺乏普遍稳定的内参基因仍然是不同患者队列和生物体液中的主要限制。不同的标准化策略，包括内源性对照和外源性添加对照，可能显著影响报告的表达水平并限制跨研究可比性。因此，miRNA生物标志物不应仅通过统计显著性或诊断性能来评估；其可靠性取决于标准化的样本类型、预处理程序、RNA提取方法、标准化策略、定量平台和外部验证。
**2.3.1 创伤性脑损伤研究中的miRNA生物标志物**
TBI相关的miRNA研究为DoC研究提供了方法学参考和候选分子，但它们应被解读为间接证据而非DoC特异性验证。先前的研究已识别出几种与TBI诊断、损伤严重程度、时间演变或长期结局相关的循环miRNAs，包括miR-93、miR-191、miR-499、miR-142-3p、miR-423-3p、miR-425-5p、miR-21和miR-219a-5p。计算机分析进一步表明，失调的miRNAs可能参与凋亡、炎症、细胞存活和PI3K/AKT相关通路，为后续DoC研究提供了合理的机制假设。
这些TBI衍生发现的主要价值在于技术和概念的转移，而非直接应用于DoC的临床适用性。它们展示了循环miRNAs如何被筛选、定量、纵向追踪以及与损伤相关的分子通路联系起来。然而，这些研究大多在急性TBI队列中进行，其中miRNA变化可能主要反映急性组织损伤、血脑屏障破坏、系统性炎症或创伤相关的应激反应。这些发现不能直接外推至pDoC、缺氧缺血性损伤、卒中相关DoC或混合病因。对于DoC研究，关键问题不在于一个miRNA在脑损伤后是否发生变化，而在于它是否提供了关于意识表型、恢复轨迹或残余网络功能的信息，超越了损伤严重程度和病因。因此，TBI衍生的miRNAs目前应被视为组合构建的候选参考，而非经过验证的DoC生物标志物。
**2.3.2 DoC特异的miRNA新发现**
与TBI衍生的证据相比，以DoC为重点的miRNA研究提供了更直接但仍是初步的miRNA分层支持。一项纵向多中心研究显示，DoC患者血清中miR-150-5p、miR-132-3p、miR-23b-3p、miR-451a和miR-16-5p的表达模式与病因和损伤后时间相关。在TBI相关的DoC中，miR-150-5p、miR-132-3p和miR-23b-3p的基线水平显著低于对照组，后两者的高表达与更好的结局相关。在HIBI相关的DoC中，miR-150-5p在基线和6个月时仍降低，而miR-451a在基线时降低，提示了病因特异性和时间依赖性的miRNA动态变化。这项研究因其纵向多中心设计和基于dPCR的定量分析而提供了相对较强的证据。然而，它专注于预设的有限组合，这提高了验证强度，但限制了对新DoC相关候选物的发现，并限制了更广泛的机制推断。
其他DoC相关的研究既强调了循环miRNA分析的潜力，也指出了其局限性。Petrova等人报告了pDoC患者血浆和CSF中miR-21、miR-93、miR-191、miR-let-7b和miR-499的差异表达，其中miR-93、miR-21和miR-191在不同病因间表现出显著差异。这表明miRNA谱可能对病因异质性比单独的意识状态更敏感。然而，缺乏血浆-CSF配对相关性分析限制了对外周miRNA信号是否反映中枢分子改变的解读。Zilliox等人识别出严重TBI诱导的DoC中55个差异表达的血miRNAs，其中6个核心miRNAs通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证，并与继发性脑损伤通路、神经修复过程、神经行为表现和损伤后持续时间相关。尽管这项RNA-seq研究提供了一个无偏倚的发现谱，但极小的样本量限制了其普遍性，并增加了已识别特征可能是队列特异性的风险。
总体而言，当前DoC相关的miRNA证据表明，循环miRNAs更适合用于亚组分层，而非独立诊断。现有发现表明，miRNA谱可能受病因、损伤后时间和恢复状态影响，但仍不清楚它们是否捕获了意识障碍本身，还是更广泛的损伤相关调控反应。因此，未来研究应从单miRNA发现转向在病因和时间分层的DoC队列中测试预设的多miRNA组合，并评估其在已建立的临床和多模态评估之外的增量价值。
这些发现表明，循环miRNAs可能更有用于捕获病因和时间异质性，而非作为意识障碍的独立诊断标志物。由于单个miRNA可能仅捕获损伤反应、炎症、修复或系统性调控中的一个组成部分，未来研究应优先考虑预设的多miRNA组合，并结合临床和神经生理变量。这些组合应在病因和时间分层的DoC队列中进行测试，包括TBI相关的DoC、HIBI相关的DoC、慢性UWS、MCS、MCS+和恢复期患者。标本选择、参考对照、qRT-PCR或dPCR条件以及独立外部验证的标准化，对于评估miRNA特征作为DoC分层的有临床意义的工具至关重要。
**2.3.3 外周血外泌体miRNA**
与游离循环miRNAs相比，外泌体miRNAs可能提供更好的稳定性和生物学特异性，因为它们被保护在囊泡内，并可能部分反映脑损伤后的细胞间通讯。在TBI研究中，血清外泌体miRNAs如miR-206和miR-549a-3p与经典损伤相关生物标志物（包括脑源性神经营养因子（BDNF）、NSE和S100B）相关联。这表明外泌体miRNAs可能捕获损伤相关的分子反应，并可能补充蛋白质生物标志物。然而，目前缺乏对DoC的直接证据，且外泌体miRNA谱是否提供超越常规循环miRNA或损伤相关蛋白标志物的信息仍不清楚。
总体而言，循环和外泌体miRNA生物标志物仍处于有前景但不成熟的阶段。关键障碍包括不一致的检测方案、可变的内参基因、异质性的分析流程以及有限的大规模多中心验证。在TBI研究中开发的诸如多miRNA组合模型和纵向动态监测等策略可能提供有用的参考，但在临床转化之前，在病因和阶段分层的队列中进行DoC特异性验证仍然至关重要。
**3 脑脊液生物标志物**
尽管外周血生物标志物因其可及性而在非侵入性筛查、预后预测和动态监测方面具有优势，但它们固有地受限于不充分的CNS特异性，因为系统性生理变化可能混淆其解读。相比之下，CSF作为直接与CNS沟通的生物体液，为评估神经炎症、突触功能障碍和代谢紊乱等病理过程提供了更核心的信息层。因此，CSF生物标志物可能在外周-中枢整合评估框架内补充血液生物标志物（图5）。然而，对其临床作用应谨慎解读：CSF生物标志物更适合用于机制阐释、选择性鉴别诊断和外周发现的中枢验证，而非常规筛查或长期重复监测。
**3.1 CSF蛋白生物标志物**
CSF蛋白生物标志物比外周血标志物更直接地暴露于中枢微环境，因此可能提供关于DoC中CNS损伤、突触功能障碍和中枢炎症反应的信息。CSF蛋白生物标志物研究的方法学从常规临床检测到复杂的多组学方法不等，反映了从临床可及的损伤标志物到面向机制发现工具的谱系。早期临床研究主要依赖易于检测但相对非特异性的损伤标志物。例如，Liu等人使用邻苯三酚红钼酸盐法和ELISA分别分析了CSF总蛋白（CSF-TP）和NSE，发现与MCS患者相比，VS患者中这两种标志物均显著升高，且联合检测显示预后价值。然而，CSF-TP是一个高度非特异性的标志物，可能因感染或出血等并发症而混淆。尽管NSE具有一定神经元相关性，但其在急性损伤后的释放动力学复杂，且可能受颅外损伤影响。因此，这些标志物更适合识别群体水平的损伤相关趋势，而非精确的个体诊断或意识障碍的机制解读。
更近期的研究使用高通量蛋白质组学来识别与突触完整性和意识相关神经功能更密切相关的CSF标志物。例如，Oh等人通过SomaScan、液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）和机器学习分析，识别出CSF YWHAG/NPTX2突触蛋白比率作为认知结局的预测因子。与CSF-TP或NSE等广泛损伤标志物相比，此类突触蛋白特征可能通过反映突触相关的功能障碍和结局相关的神经变化，提供超越一般损伤负担的信息。然而，此类方法的复杂性、成本和技术要求目前限制了其常规临床应用。
与血液样本相比，CSF蛋白生物标志物具有重要的实际局限性。CSF采集通常是侵入性的，患者耐受性差，因而不适合长期动态监测。某些生物标志物缺乏特异性，可能被感染、出血或其他并发症等因素混淆。相比之下，在TBI背景下，血清检测GFAP和S100B等蛋白侵入性较低且具有更广泛的临床应用性。
**3.2 CSF中的代谢改变**
CSF代谢组学聚焦于CNS局部的代谢紊乱，能够识别DoC大脑中核心病理通路的失调。然而，当前证据仍处于探索阶段，主要发现来自小型队列、非靶向平台和多变量发现模型。
近期研究表明，CSF代谢特征可能有助于意识水平区分和结局预测。Wang等人识别了DoC患者中14种差异CSF代谢物，主要涉及坏死/凋亡、氨基酸代谢和神经保护相关通路。麦角硫因在MCS患者中显著上调，而PC (34:2)与脑损伤严重程度呈负相关。由麦角硫因和PC (34:2)组成的CSF组合在区分UWS与MCS时达到了0.85的AUC。类似地，Xu等人在51名DoC患者中使用基于LC–MS的CSF代谢组学，报告了与病因相关的酰基肉碱谱、与意识水平相关的谷氨酸-γ-氨基丁酸（GABA）代谢物以及与预后相关的磷脂，报告的最高AUC达到0.92。这些发现表明CSF代谢物可能捕获与病因、意识水平和预后相关的中枢代谢改变。尽管如此，它们的临床准备程度仍然有限，因为大多数候选组合尚未经过独立的外部验证。
从机制上讲，CSF代谢改变可能反映与DoC相关的中枢过程，包括氨基酸神经传递、能量代谢、磷脂重塑、神经炎症和血脑屏障功能障碍。然而，这些特征是否特异性地反映意识障碍，还是更广泛的CNS损伤、疾病阶段和继发性并发症，仍不确定。从转化角度来看，CSF代谢组学更适合用于机制探索、靶点发现和外周发现的中枢验证，而非常规筛查。在Wang等人的研究中，血清代谢组学显示出比CSF代谢组学更高的诊断性能和更大的重复检测可行性，支持CSF代谢分析发挥补充而非竞争作用。
尽管基于LC–MS的非靶向平台是检测CSF代谢改变的有力工具，但其输出仍对峰拾取、对齐、标准化、质量控制、代谢物鉴定和多变量建模敏感。因此，未来研究应建立共识性的CSF代谢组学工作流程，并在按病因、意识水平、疾病阶段和结局分层的多中心DoC队列中验证预设的代谢物组合。
**3.3 CSF中的miRNA生物标志物**
作为中枢特异性的调控分子，CSF miRNAs可能提供与DoC病因分层和病理机制研究相关的脑内基因调控变化信息。然而，它们目前的作用仍处于探索阶段，直接的临床适用性需要进一步验证。研究已报告pDoC患者CSF中miR-21、miR-93、miR-191、let-7b和miR-499的表达存在显著差异，在区分TBI相关的DoC与HIBI相关的DoC方面具有潜在价值。这些研究使用TaqMan探针定量聚合酶链反应（qPCR），并引入外源性cel-miR-39进行标准化。这些发现表明CSF miRNAs可能通过提供更接近CNS的调控信号来补充血miRNAs，用于病因分层。然而，该研究是假设驱动的，测试了已知与脑损伤相关的miRNAs，可能遗漏了新的DoC特异性候选。相对较小的样本量也限制了统计效能和普遍性。
一些实验研究进一步探讨了特定miRNAs在CNS内的功能作用。例如，对miR-142-3p和miR-451a的研究表明，这些miRNAs可能通过星形胶质细胞谷氨酸转运体和Toll样受体4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）信号等通路参与兴奋毒性或神经炎症调控。这些研究提供了机制假设，但大部分证据来自动物模型或细胞实验，而非DoC队列中的直接验证。因此，这些miRNAs应被视为生物学上合理的候选物，而非已确立的DoC CSF生物标志物。
总之，CSF蛋白、代谢物和miRNA生物标志物共同构成了一个中枢信息层，用于DoC的机制阐释、病因鉴别、靶点发现和选择性鉴别诊断，尤其是在与外周生物标志物结合的双生物体液策略中。然而，当前的CSF发现仍然异质，范围从低特异性的常规损伤标志物到更面向机制的蛋白质组学或分子候选物，这些仍需独立验证。
从更广泛的临床角度来看，CSF生物标志物不太可能取代血液生物标志物，因为CSF采集是侵入性的，不适合重复监测，并且可能在长期卧床或临床不稳定的DoC患者中难以实施。腰椎穿刺还可能受到禁忌症或并发症的限制，如凝血异常、脊柱损伤、颅内高压、穿刺后头痛、出血、CSF渗漏或感染。因此，CSF生物标志物更适合作为机制确认、中枢验证或鉴别诊断的选择性辅助工具，而外周血生物标志物在纵向监测、大规模研究和未来临床实施中仍更具可行性。
**4 粪便生物标志物**
在CSF生物标志物的中枢信息和血液生物标志物的临床可及性基础上，粪便生物标志物通过肠脑轴（GBA）成为DoC研究中的一个探索性前沿。粪便生物标志物，包括肠道微生物群及其代谢物，可能通过反映与神经、免疫和内分泌途径相关的GBA改变，提供对潜在干预靶点的见解，从而扩展了“中枢-外周-肠道”多模态框架。
在pDoC患者中，初步研究表明肠道菌群失调、微生物代谢物、电生理特征和意识水平之间存在关联。然而，该领域仍处于早期探索阶段。当前证据主要来自小样本量、单中心研究、临床前模型以及相关神经或系统疾病的间接发现。因此，
