《Frontiers in Immunology》：Integrated single-cell and bulk RNA sequencing analyses identify a myeloid state-related gene signature for molecular subtyping in stomach adenocarcinoma
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目的：胃腺癌（stomach adenocarcinoma, STAD）具有显著的异质性，其中髓系细胞扮演着关键但尚未完全理解的角色。髓系细胞的功能状态、患者预后和治疗反应之间的关系需要进一步阐明。方法：研究人员整合了来自TCGA-STAD队列的单细胞RNA测
目的：胃腺癌（stomach adenocarcinoma, STAD）具有显著的异质性，其中髓系细胞扮演着关键但尚未完全理解的角色。髓系细胞的功能状态、患者预后和治疗反应之间的关系需要进一步阐明。方法：研究人员整合了来自TCGA-STAD队列的单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）图谱和443个批量RNA测序（bulk RNA-seq）图谱。通过将Monocle2伪时间分析（pseudotime analysis）推断的髓系细胞分化轨迹与生存分析相结合，研究人员识别出髓系状态相关预后基因（myeloid state-related prognostic genes, MSRPGs）并构建了一个分子分类（STAD-MSC）。研究人员还探讨了其预后意义和多组学特征。此外，研究人员利用相关分析建立了调控网络并预测了候选抑制剂。在包含355例患者的公共验证队列中评估了5基因风险模型，并在包含70例患者的回顾性队列中通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测NNMT、AXL和COL1A1在蛋白水平进一步评估了STAD-MSC框架。结果：研究人员在五个不同的髓系状态中识别出32个MSRPGs。共识聚类将患者分为三个亚型，包括低免疫浸润STAD（LI-STAD）、中等免疫浸润STAD（MI-STAD）和高免疫浸润STAD（HI-STAD）。HI-STAD亚型以高免疫浸润伴随免疫抑制和功能失调微环境为特征，显示出最差的总生存期（global log-rank p=0.018）。多组学分析揭示了亚型特异的基因组和免疫景观。构建了5基因预后特征并作为风险相关预后模型进行评估。计算机模拟（in silico）分析识别出预测药物反应中的亚型相关差异。探索性药物基因组分析揭示了达拉非尼（dabrafenib, p=0.0051）和鲁索替尼（ruxolitinib, p=041）的名义关联，提示潜在的亚型特异性治疗弱点。重要的是，三个蛋白分类器（NNMT/AXL/COL1A1）将一个含70例患者的回顾性队列分为三个具有显著不同总生存期和无进展生存期的亚组。结论：通过公共队列和蛋白水平临床验证，研究人员建立了STAD-MSC，一种以髓系状态为中心的分子分类学，将STAD患者分为具有不同预后和免疫抑制微环境特征的亚组，为免疫知情患者分层提供了一个框架。
胃腺癌（stomach adenocarcinoma, STAD）是全球第五大常见恶性肿瘤，2022年新发病例约96.8万，死亡66万例。尽管内镜、影像和靶向治疗有所进步，晚期患者中位生存期仍不足1年。肿瘤的显著异质性使得病理分类不足以指导个体化治疗，而肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中髓系细胞（myeloid cells）的功能状态与预后和治疗反应密切相关，但其分化轨迹如何影响免疫抑制和预后尚不清楚。为填补这一空白，研究人员通过整合单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）和批量RNA测序（bulk RNA-seq），以髓系细胞状态为切入点，构建了基于髓系状态相关预后基因（myeloid state-related prognostic genes, MSRPGs）的分子分类（STAD-MSC）。该分类将患者分为低免疫浸润（LI-STAD）、中等免疫浸润（MI-STAD）和高免疫浸润（HI-STAD）三个亚型，其中HI-STAD虽免疫浸润最高，却呈现免疫抑制和微环境功能失调，预后最差。研究人员进一步构建了5基因风险模型（SPARC、TFPI、BEX3、PLOD2、CXCR4），并在公共队列和蛋白水平（NNMT、AXL、COL1A1）验证了其预后价值。该研究为免疫知情的患者分层和探索性治疗假说提供了框架，已发表在《Frontiers in Immunology》上。
**关键技术方法**：研究人员从GEO数据库（GSE183904）获取scRNA-seq数据，从TCGA获取443例STAD的bulk RNA-seq数据。使用Seurat进行单细胞质控、降维和细胞注释，并通过SingleR和CellMarker数据库确定细胞类型。利用Monocle2进行伪时间轨迹分析（DDRTree算法），识别出5个髓系细胞状态及相关基因（MSRGs）。在TCGA队列中通过Kaplan?Meier和单变量Cox回归筛选出32个与总生存显著相关的MSRPGs。基于MSRPGs表达谱，采用ConsensusClusterPlus进行共识聚类，通过CDF曲线和PAC值选定k=3，建立STAD-MSC分类。使用CIBERSORT、ssGSEA和TIDE算法评估免疫浸润与免疫功能障碍。通过CCLE和GDSC数据库匹配进行药物敏感性预测。采用LASSO回归从32个MSRPGs中筛选5个基因构建风险模型，并在GSE62254和GSE84437队列中外部验证。在70例瑞金医院回顾性队列中，对NNMT、AXL和COL1A1进行免疫组化（IHC）染色，基于H-score进行蛋白水平亚型分类。
**研究结果**：
**3.1 髓系细胞在肿瘤微环境中的鉴定**：通过scRNA-seq分析40例STAD样本，识别出6种主要细胞类型（B/浆细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞、NK/T细胞）。髓系细胞与其他细胞存在广泛配体-受体相互作用，提示其在TME中的中枢调控作用。
**3.2 轨迹分析描绘转录动力学和髓系细胞状态**：Monocle2伪时间分析显示髓系细胞具有5个分化状态（状态1为早期，状态4、5为终末分支），识别出与状态相关的差异表达基因，定义为髓系状态相关基因（MSRGs）。
**3.3 确定髓系状态相关预后基因**：将MSRGs与TCGA队列中Kaplan?Meier（p<0.05）和单变量Cox（p<0.01）筛选出的预后基因取交集，获得32个MSRPGs。这些基因均为风险因子，分布于不同分化状态，如状态1包含PD-L1/CD274、AXL等免疫抑制相关基因。
**3.4 STAD-MSC及其免疫学意义**：基于32个MSRPGs的共识聚类将TCGA队列分为LI-STAD、MI-STAD和HI-STAD三个亚型。生存分析显示HI-STAD预后最差（global log-rank p=0.018），其免疫浸润最高但伴随T细胞功能障碍、排斥增加、癌症相关成纤维细胞（CAF）富集和免疫检查点高表达。PCA评分与免疫浸润负相关，低PCA评分（对应HI-STAD）患者OS更差。
**3.5 多组学分析**：HI-STAD（低PCA组）突变率约50%，而LI-STAD约25%；VCAN和COL1A2突变常见。肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）与PCA评分线性相关，高TMB合并高PCA评分患者OS最优。拷贝数变异（CNV）分析显示MSRPGs存在频繁变异，但mRNA表达与CNV相关性较弱。
**3.6 肿瘤与正常组织差异分析**：所有32个MSRPGs在肿瘤组织中显著差异表达。转录因子和通路富集分析显示肿瘤组织激活MYC靶点、E2F靶点、G2M检查点和mTORC1信号通路，抑制KRAS信号、胆汁酸代谢等通路。
**3.7 构建三个STAD亚型的调控网络**：基于相关分析构建亚型特异性调控网络。HI-STAD中SDC2和COL1A1与上皮间充质转化（EMT）通路共表达；MI-STAD中AXL和SERPINF1与转录因子MYH11、MAF及II型IFN应答共表达；LI-STAD中NNMT和EFEMP1主导，EFEMP1与MAF（R=0.70）及II型IFN应答（R=0.64）高度相关。ATAC-seq显示关键基因（AXL、COL1A1等）启动子区染色质开放。
**3.8 探索亚型相关药物敏感性**：通过CCLE和GDSC匹配，预测HI-STAD亚型对达拉非尼（dabrafenib, p=0.0051）和鲁索替尼（ruxolitinib, p=0.041）更敏感，而5-氟尿嘧啶（p=0.074）和莫特沙尼（motesanib, p=0.076）无显著亚型差异。
**3.9 构建和验证预后预测模型**：通过LASSO回归从32个MSRPGs中筛选出5个基因（SPARC、TFPI、BEX3、PLOD2、CXCR4）构建风险评分。在TCGA训练集和测试集及公共验证队列（GSE62254和GSE84437）中，高风险组OS显著更差；多因素Cox回归显示风险评分是独立预后因子（HR=6.353，p<0.001）。高风险组富集细胞粘附分子、细胞因子信号和ECM受体通路，低风险组富集基础代谢和蛋白合成通路。
**3.10 免疫微环境特征与风险分层的关联**：高风险组主要表现为C2免疫亚型（炎症型），免疫浸润以免疫抑制和排斥为特征，TIDE评分（功能障碍和排斥）显著升高；低风险组MSI更高，免疫浸润模式不同。
**3.11 蛋白水平临床验证**：在70例瑞金医院回顾性队列中，基于NNMT、AXL和COL1A1的IHC H-score将患者分为LI-STAD（44.29%）、MI-STAD（20%）和HI-STAD（35.71%）。HI-STAD患者总生存期和无进展生存期显著最差（OS p=0.045，PFS p=0.013），多因素分析显示LI-STAD是PFS的保护因素（HR=0.18，p=0.0093）。
**讨论**：STAD-MSC弥补了现有TCGA和ACRG分子分类对TME尤其是髓系细胞状态关注的不足。HI-STAD亚型虽然免疫浸润最高，但以免疫抑制和T细胞管理排斥为特征，这与其肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的M2极化、CAF介导的基质硬化和NNMT驱动的代谢重塑相关。5基因风险模型整合了基质重塑（SPARC、PLOD2）、血管生成（TFPI）、免疫趋化（CXCR4）和应激适应（BEX3），优于单一标志物。蛋白水平三分类器（NNMT/AXL/COL1A1）可在常规病理中推广应用。局限性包括：所有分析均为回顾性，因果推断需实验验证；蛋白验证队列样本量小（仅62例有随访数据），事件数有限（11例死亡，16例进展），多因素分析应视为探索性；药物敏感性预测为计算推断，需临床前模型验证。**结论**：总之，研究人员建立并初步评估了STAD-MSC，一种基于髓系细胞转录状态的新型胃腺癌分子分类，将患者分为三个预后组（HI-STAD、MI-STAD、LI-STAD）。5基因风险模型在TCGA队列内评估并在GSE62254和GSE84437队列中外部验证，三蛋白分类器（NNMT/AXL/COL1A1）提供了蛋白水平临床分层。高危HI-STAD亚型以髓系细胞中SPARC、THBS2和CXCR4高表达为特征，与不良预后相关。该工作为免疫知情患者分层提供了框架，并提出了需要进行临床前模型验证的探索性治疗假说。
