《Frontiers in Immunology》：Bacillus Calmette-Guérin as adjuvant platform enhances immunogenicity of conserved epitopes from structural proteins of SARS-CoV-2
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开发针对SARS-CoV-2的有效且广泛保护性疫苗仍是全球优先事项。病毒结构蛋白（E、M、N和S）中的保守表位是受新现突变影响较小的潜在靶点，而卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)具有独特的佐剂和递送特性。本研究旨在结合BCG验
开发针对SARS-CoV-2的有效且广泛保护性疫苗仍是全球优先事项。病毒结构蛋白（E、M、N和S）中的保守表位是受新现突变影响较小的潜在靶点，而卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)具有独特的佐剂和递送特性。本研究旨在结合BCG验证保守的SARS-CoV-2表位，并在计算机(in silico)中设计多表位疫苗构建体。Dot blot assay确认了5条合成肽可被康复患者血清识别。体外(in vitro)实验中，BCG-肽制剂激活了巨噬细胞中的MAPK通路并诱导了训练免疫(trained immunity)特征。体内(in vivo)实验中，免疫小鼠显示IgG亚类调控及IL-6、TNF-α和IFN-γ产生增加。接种疫苗动物的脾细胞在再次刺激后分泌高水平细胞因子，提示存在记忆应答。计算机建模表明稳定的、具抗原性且无过敏性的多表位构建体具有有利的免疫模拟结果。综上，这些发现凸显了BCG-表位制剂作为针对SARS-CoV-2的下一代候选疫苗的前景。
该研究发表于《Frontiers in Immunology》。研究背景方面，COVID-19大流行由SARS-CoV-2引起，截至2025年8月报告约7.8亿病例和710万死亡，病毒传播控制依赖全球大规模疫苗接种，覆盖率达90%至100%，但其季节性模式尚未明确，未来循环动态不确定，病毒防控将主要依赖针对老年人和免疫缺陷等脆弱人群的大规模疫苗接种。现有常规或下一代疫苗包括灭活病毒疫苗、病毒载体和信使RNA平台，均显示降低病毒载量的高效力，大多靶向Spike(S)蛋白，该蛋白携带多数新现突变尤其是受体结合域(receptor-binding domain, RBD)，可能利于关切变异株(variants of concern, VOCs)出现并损害疫苗长期效力。相比之下，包膜(Envelope, E)、膜(Membrane, M)和核衣壳(Nucleocapsid, N)等其他结构蛋白具有相对保守区域和公认抗原潜力。研究人员此前通过计算机分析识别出结构蛋白中具高MHC结合潜力及CD4+和CD8+T淋巴细胞活化能力的保守表位，但这些表位单独引发应答较弱，需佐剂增强免疫原性。卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)作为佐剂和递送平台具广泛免疫调节效应、诱导训练免疫及可能对病毒感染提供交叉保护，且BCG与SARS-CoV-2特异性抗原组合已诱导强健细胞应答和高抗体滴度，异源关联BCG与肽也具显著潜力。因此研究人员旨在评估BCG作为异源佐剂递送保守SARS-CoV-2表位所诱导的免疫应答，通过体外、体内及计算机途径验证其刺激细胞和体液应答能力并预测多表位构建体，以贡献于提供针对SARS-CoV-2变异株更广泛保护的下一代疫苗开发。
为开展研究，研究人员采用的主要关键技术方法包括：合成源自SARS-CoV-2结构蛋白的5条免疫显性合成肽并由康复患者血清样本进行Dot blot杂交 assay 验证识别；使用HEK 293F细胞表达并纯化重组RBD蛋白；分离培养C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)进行Western blotting分析MAPK通路蛋白及ELISA检测细胞因子；以雌性C57BL/6小鼠为动物模型进行肌肉免疫，采集血清与脾脏样本通过ELISA检测总IgG及亚类、流式微球阵列(Cytometric Bead Array, CBA)分析细胞因子；通过计算机设计含β-defensin与PADRE序列的多表位嵌合蛋白，利用ProtParam、VaxiJen v2.0、AllerCatPro v2.0评估理化与抗原过敏性，AlphaFold3进行三维建模，GROMACS进行60 ns分子动力学模拟，ClusPro进行TLR对接，C-ImmSim进行免疫模拟，血清样本来源于2020年3月至6月巴西Institute of Infectology Emilio Ribas与Institute Adolfo Lutz确诊SARS-CoV-2感染患者及2019年9月前阴性对照。
研究结果部分保留小标题并说明如下：
3.1 Immune epitope mapping by dot blot serological assay。研究人员通过Dot blot assay优化并用确诊SARS-CoV-2感染患者血清（按严重程度分层）及疫情前阴性血清，评估5条合成线性肽（P1来自E蛋白、P2来自M蛋白、P3来自N蛋白、P4和P5来自S蛋白）的IgG抗体反应，密度测定分析确认所有5条肽和RBD均被各临床严重程度组感染者血清识别，无关对照牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)无反应性，且不同严重程度组内信号强度有差异但所有感染者均一致识别5条肽，验证了表位抗原性及在自然感染中被呈递。
3.2 Peptide stimulation combined with BCG activates the MAPK pathway and enhances inflammatory responses in restimulated BMDMs。研究人员用BCG（MOI 0.1）单独或联合肽刺激小鼠BMDMs并进行两次刺激，Western blot分析显示BCG与肽制剂再次刺激导致MAPK通路更强劲激活，尤其p38 MAPK磷酸化在P2、P3、P4和P5组显著增加，ERK1/2磷酸化强度降低，JNK和SAPK激活较温和，再次刺激较初次刺激p38磷酸化更高；ELISA显示再次刺激后IL-6、IL-1β和TNF-α分泌较单次刺激显著增加，表明BCG-肽制剂选择性调节MAPK通路尤其p38磷酸化并在再次刺激放大炎症反应，支持诱导训练免疫表型。
3.3 BCG combined with SARS-CoV-2 peptides induces elevated IgG subclasses and circulating IL-6, TNF-α, and IFN-γ。研究人员对C57BL/6小鼠肌注免疫BCG或BCG联合5种肽，30天后采血分析，总IgG无显著差异但BCG+P3有增加趋势；IgG1在BCG+P3和BCG+P4组较未处理(not treated, NT)显著增加且BCG+P3最高；IgG2c在BCG和BCG+P5组较NT显著增加，BCG+P4较BCG和BCG+P5显著降低；IgG1/IgG2c比值显示NT、BCG、BCG+P2、BCG+P5低于1提示Th1偏态，BCG+P1接近1平衡，BCG+P3和BCG+P4高于1提示Th2偏态；血清CBA显示所有组IL-6较NT显著增加，IL-10无差异，BCG组IL-17显著高于NT且较多数肽组高，BCG+P1的IFN-γ较所有组显著升高，TNF-α在BCG组较NT及P2、P3、P4显著升高，BCG+P1较NT、P2、P3、P4升高，BCG+P5较NT、P2、P3、P4升高，表明制剂调控体液质量与极化及系统性细胞因子。
3.4 Splenocytes from mice immunized with BCG–peptide formulations exhibit increased IL-6, TNF-α, and IFN-γ secretion ex vivo。研究人员将免疫小鼠脾细胞体外培养并用培养基、肽、BCG或BCG+肽刺激24小时，CBA分析显示培养基或肽单独刺激产生低水平IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α且无显著差异，而BCG或BCG+肽刺激诱导显著增高，所有免疫组（NT、BCG、BCG+P1至P5）在BCG或BCG+肽刺激下较对照均显示细胞因子分泌显著增高，表明BCG作为强效佐剂促进已免疫脾细胞激活并产生记忆应答特征。
3.5 Design and in silico evaluation of multiepitope vaccine candidates incorporating SARS-CoV-2 structural epitopes。研究人员基于验证的P1至P5表位设计三种多表位候选疫苗，保留病毒拓扑顺序并变换连接子为柔性(GGGGGG)、刚性(EAAAK)或可切割(PLGLWA)，N端加入β-defensin与PADRE及刚性连接子；VaxiJen 2.0抗原性值均>0.5（柔性0.635、刚性0.609、可切割0.593），AllerCatPro 2.0均无致敏性，ProtParam不稳定指数<40稳定、SoluProt>0.85可溶、pI~9.9；AlphaFold3三维建模辅因子区域高置信；GROMACS 60 ns分子动力学RMSD显示刚性蛋白偏差最低(0.5–1.4 nm)最稳定，可切割0.5–1.9 nm，柔性0.5–2.3 nm；ClusPro分子对接TLR4结合能柔性最优(-1050.8 kcal/mol)，可切割-1018.8，刚性-1018.3；C-ImmSim免疫模拟三剂后所有构建体均预测强健体液与细胞应答，柔性抗体峰值~140,000最高，刚性与可切割~120,000，所有构建体IFN-γ~450,000且危险指数为零，柔性体液最强、刚性结构最稳、可切割平衡，总体支持多表位构建体作为候选疫苗。
讨论部分总结：SARS-CoV-2突变更突显靶向保守区及其他蛋白的疫苗必要性，亚单位肽疫苗可选保守区且适用于风险群体，研究人员此前计算机识别表位需实验验证，本研究证实所有预测肽被康复患者血清抗体识别，具转化相关性及诊断潜力；表位单独免疫原性低需佐剂，BCG兼具佐剂与递送平台并可诱导训练免疫与交叉反应，本研究强化此潜力并显示BCG联合保守表位诱导强健先天与适应应答；Dot blot支持E、M、N、S蛋白合成肽抗原性及N蛋白(P3)高潜力；BCG-肽制剂促进p38 MAPK磷酸化及IL-6、IL-1β、TNF-α分泌支持训练免疫表型与MAPK调节；体内BCG联合肽诱导差异IgG亚类反映Th2与Th1极化并调控体液质量，细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6升高与文献中BCG佐剂效应一致，脾细胞再刺激增强细胞因子显示超越经典BCG的免疫激活；计算机多表位构建体具良好抗原性、稳定性及TLR4互作与强IgG和IFN-γ预测，结合BCG平衡免疫策略有望克服S蛋白局限；综上支持BCG作为递送系统与佐剂用于保守表位以同时参与训练先天免疫与适应应答提供广泛持久保护，但研究为初始临床前模型无直接病毒攻击、仅用雌性动物限制推广、需未来纳入两性年龄及病毒攻击模型与临床试验验证安全有效。
结论部分翻译：本研究证明SARS-CoV-2结构蛋白保守表位可被康复患者抗体自然识别，并与BCG联用可被增强，导致激活兼容训练先天免疫的MAPK通路及小鼠体内强健适应应答。观察到的IgG亚类与细胞因子产生调控支持BCG作为多功能佐剂或递送平台桥梁先天与适应免疫的作用。此外，计算机分析确认含这些肽的多表位构建体展现有利抗原性、稳定性与免疫模拟特征，柔性及刚性变体尤为前景原型。总之，这些发现为开发结合保守表位与BCG策略以实现针对SARS-CoV-2变异株更广泛持久保护的下一代疫苗提供概念验证。然而，仍需带病毒攻击模型的进一步临床前研究及后续临床验证以确认该策略转化潜力。
