《Frontiers in Immunology》：Association of APOBEC mutagenesis with stromal and endothelial niche remodeling and PCDH9-linked signaling alterations in colorectal cancer
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背景：APOBEC 胞苷脱氨酶会产生特征性的 TCW 上下文突变从而使癌症基因组多样化，但其对结直肠癌(CRC)进展及肿瘤微环境(TME)的功能影响仍不明确。方法：研究人员整合了多队列数据集的全外显子测序、批量和单细胞转录组学，并辅以功能实验和体内异种移植模型
背景：APOBEC 胞苷脱氨酶会产生特征性的 TCW 上下文突变从而使癌症基因组多样化，但其对结直肠癌(CRC)进展及肿瘤微环境(TME)的功能影响仍不明确。方法：研究人员整合了多队列数据集的全外显子测序、批量和单细胞转录组学，并辅以功能实验和体内异种移植模型，以描绘 CRC 中 APOBEC 激活的生物学与临床后果，采用机器学习框架推导 APOBEC 激活相关转录特征(AAS)。结果：在多队列数据集中，AAS 定义了一种富集 TCW 诱变且生存显著更差的结直肠癌亚型。高 AAS 肿瘤与 TME 的协调重塑相关，包括成纤维细胞和内皮特征增加以及细胞毒性免疫浸润减少。单细胞分析表明高 AAS 肿瘤富集具有动脉和促血管生成特征的内皮状态。条件培养基实验进一步支持肿瘤细胞分泌组介导的 APOBEC3B 激活与内皮转录重塑之间的潜在联系。整合分析将 PCDH9 确定为与 Hippo、Wnt/β-catenin 和 TGF-β 信号改变相关的候选 APOBEC 关联靶点，而突变特异性因果关系仍有待实验验证。结论：这项多组学研究确定 APOBEC 活性是 CRC 演进的核心调控因子，与通过 PCDH9 关联信号改变实现的基质血管重塑和细胞内致癌激活相关。AAS 提供了一种稳健的预后生物标志物，并强调高 APOBEC 肿瘤是抗血管生成治疗及靶向 APOBEC 诱导信号脆弱性干预措施的候选对象。
该研究发表于《Frontiers in Immunology》。目前关于 APOBEC 胞苷脱氨酶家族介导的特征性 TCW 上下文突变虽在多种癌症中被识别，但其如何超越突变来源的角色塑造结直肠癌（CRC）下游生物学程序，以及对肿瘤微环境（TME）重编程的贡献和介导的细胞程序或靶点均缺乏系统性表征。鉴于 APOBEC 关联突变与基因组不稳定性、转移及不良预后相关，且 CRC 中存在大量未解释的突变事件，研究人员开展此项多组学研究以阐明 APOBEC 激活在 CRC 演进中的功能影响及其与微环境的交互作用，并识别潜在的诊疗靶点。
研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括：样本来源于 TCGA-CRC（546 例）、MSK-CRC（1516 例）及 GEO 队列（GSE17536、GSE17537、GSE29621、GSE39582）和 scRNA-seq 数据集（GSE132465、GSE144735），辅以中国医科大学第一医院的 200 例独立 CRC 队列；技术涵盖全外显子测序（WES）体细胞变异处理与突变特征分解、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、10 种机器学习算法组合构建 APOBEC 激活相关转录特征（AAS）及外部验证、多种算法（EPIC、CIBERSORT、quanTIseq、MCP-counter、xCell）评估免疫基质浸润、Seurat 单细胞转录组分析与细胞注释、CellChat 细胞通讯分析、Monocle2/3 及 VECTOR 内皮细胞轨迹推断、Mfuzz 软聚类、ELISA 检测分泌因子、Western blotting 通路蛋白检测、CCK-8 增殖、流式凋亡、Transwell 迁移侵袭及体内皮下异种移植模型。
3 结果
3.1 APOBEC 关联突变富集定义具有临床相关性的 CRC 亚型。研究人员通过分析 TCGA-CRC 和 MSK-CRC 突变队列的体细胞突变谱，量化 TCW 突变作为 APOBEC 活性替代指标，发现高 TCW 突变组富集典型 APOBEC 特征 SBS13 及 SBS2，且总生存显著更差，证实 TCW 突变富集是 CRC 中 APOBEC 活性的可靠读数并与不良临床结局相关。
3.2 APOBEC 活性相关预后特征的构建。研究人员整合 TCW 突变基因、WGCNA 进展相关基因及单变量 Cox 预后基因筛选出 105 个基因，通过 100 种机器学习模型配置评估，选定 Lasso 联合随机生存森林（RSF）模型构建由 22 个基因组成的 AAS。独立 200 例 CRC 队列验证显示 AAS 高分与高 TCW 突变负担及更差生存相关，AAS 是兼具中等但可重复预后性能的生物标志物。
3.3 APOBEC 激活特征与临床结局的关联。研究人员在 TCGA-CRC 及合并 GEO 队列、独立 200 例队列中证实 AAS 富集组总生存显著劣于耗竭组，且 AAS 随疾病分期进展和死亡状态升高。多变量 Cox 回归确认 AAS 与年龄为独立预后因素，整合二者的列线图在 1、3、5 年生存预测中校准度良好且决策曲线分析显示净获益优于单一临床变量。
3.4 AAS 富集肿瘤与 CRC 中基质富集及成纤维细胞扩张相关。批量和单细胞转录组分析显示 AAS 富集肿瘤基质浸润（成纤维细胞、内皮细胞（ECs）、周细胞）升高，细胞毒性免疫群体（CD8+T 细胞、树突状细胞、浆细胞、NK 细胞、B 细胞）减少。单细胞数据中成纤维细胞 AAS 评分最高且在富集组中比例增加，免疫荧光验证高 AAS 肿瘤 α-SMA+成纤维细胞密度增加，伪时间分析提示 APOBEC 激活主要扩增而非诱导成纤维细胞新状态。
3.5 AAS 富集肿瘤显示增强的基质免疫通讯及促肿瘤信号网络。CellChat 分析显示 AAS 富集肿瘤细胞间互作数量和强度增加，基质与免疫抑制谱系（成纤维细胞、ECs、周细胞）互作增强，通路富集 ECM 重塑、血管生成、免疫抑制及慢性炎症状态，配体受体水平显示 TN、FN1、THBS、CSPG4 及胶原等 ECM 分子互作增强，GSVA 一致富集 EMT 和 TGF-β 信号，且 AAS 与血管生成活性正相关。
3.6 AAS 富集肿瘤与内皮状态向动脉及促血管生成表型偏移相关。单细胞鉴定 8 种 EC 亚群，AAS 富集组中 Ven-EC、Cap-EC、Art-EC 等多亚群扩张。轨迹推断揭示 Ven-EC → Cap-EC → Art-EC 转录连续体，基因动态显示晚期动脉状态富集血管生成及 EMT 等，AAS 沿静脉至动脉轴单调升高，高 Art-EC 丰度与更差生存相关（HR = 1.60；95% CI 1.07–2.38）。条件培养基刺激 EC 的 RNA-seq 及 Mfuzz 聚类复现此成熟序列，AAS 富集肿瘤高表达 VEGFR、FGFR、PDGFR-α。
3.7 APOBEC3B 激活伴随 TCW 上下文突变及分泌组相关因子改变。研究人员证实 APOBEC3B 较 APOBEC3A 对 TCW 突变负担贡献更大，Tet-On 诱导 APOBEC3B 模型显示时间依赖性 TCW 突变累积具催化活性依赖性。OE-A3B 细胞胞苷脱氨酶活性升高，22 个 AAS 基因中 7 个差异表达，功能富集指向 Hippo、Wnt/β-catenin、TGF-β 通路。ELISA 显示 OE-A3B 细胞 WNT7B 分泌升高、BMP6 降低。PCDH9 与 AAS 相关性最高且为 AAS 模型顶级枢纽基因，其 TCW 突变位于钙粘蛋白重复域，结构建模预测可能破坏胞外域折叠。
3.8 PCDH9 恢复减弱 APOBEC3B 关联致癌信号及恶性表型。OE-A3B 细胞中 Hippo 信号（p-MST1/2、p-LATS1、p-YAP 降低）受抑，Wnt/β-catenin（β-catenin、S100A4、c-MYC、ANGPT2 升高）及 TGF-β（TGFβR1、TGFβR2、p-SMAD2/3、SERPINE1 升高）激活。恢复 PCDH9 表达逆转上述通路改变，并在体外抑制增殖、促进凋亡、减弱迁移侵袭，体内异种移植模型中减小肿瘤体积与重量。
讨论部分总结：研究人员指出 CRC 异质性中 AAS 定义了具转录重塑、基质富集、血管状态改变及 PCDH9 关联信号改变的侵袭性亚型，APOBEC 与免疫抑制基质扩增、动脉样内皮状态及 PCDH9 胞内抑癌信号破坏相关。既往研究多关注 SBS2/13 特征或超突变，未阐明微环境组织及谱系行为，本研究整合分析支持 APOBEC 关联程序与 CRC 促血管生成及免疫抑制生态相关。APOBEC3B 在 CRC 中表达及预测重要性高于 APOBEC3A 但非排他。诱导 APOBEC3B 模型显示催化活性依赖的时间累积突变，伴 WNT7B 和 BMP6 分泌改变，提示分泌组重塑可能介导基质内皮变化。内皮可塑性支持下 EC 状态异质性，多算法轨迹推断支持静脉/毛细血管向动脉样状态连续体但非体内谱系转换确证。PCDH9 为候选效应因子，其 TCW 突变位于钙粘蛋白重复域且结构预测受影响，恢复 PCDH9 可逆转信号与表型，但突变特异性因果及并行 APOBEC 靶基因尚需验证。体外模型仅部分重现 AAS 基因反映 AAS 为肿瘤复合表型。AAS 为补充性组织预后标志物，具抗血管生成治疗分层潜力，PCDH9 为候选脆弱点。研究局限包括 TME 关联主要为观察性、内皮方向性为计算推断、AAS 需前瞻性验证、体外模型不完全、PCDH9 结构为预测、突变因果未证等，未来需功能缺失、突变特异性挽救、空间转录组、谱系追踪等验证。
结论部分翻译：总之，研究人员的多组学研究确定了定义一种以基质主导、血管特化及免疫抑制为特征的 CRC 亚型的 AAS。研究人员进一步将 PCDH9 确定为与 APOBEC 相关信号改变关联的候选基因，提示其可能与致癌的 Hippo、Wnt/β-catenin 和 TGF-β 通路激活存在潜在联系。这些发现凸显 APOBEC 关联程序既可作为预后生物标志物，也可作为潜在治疗脆弱点，为 CRC 风险分层及制定定制化策略提供了机遇。
