加热不燃烧烟草气溶胶对体外人全唾液细菌形成的生物膜微生物组的影响

《Clinical Oral Investigations》：Influence of heat-non-burn tobacco aerosol on the microbiome of biofilm from human whole saliva bacteria in vitro

　　

摘要
目的加热不燃烧烟草产品IQOS（I Quit Ordinary Smoking）近年来被广泛使用。然而，IQOS气溶胶对口腔微生物组的影响仍不明确。因此，本研究旨在使用标准化生物膜反应器，研究IQOS气溶胶对人类唾液形成的微宇宙生物膜（microcosm biofilms）微生物组成的影响。
材料与方法构建了一个定制设计的生物膜反应器，以实现生物膜间歇性暴露于IQOS气溶胶。在具有规定表面（19.635 mm2）的牛牙釉质样本上形成微宇宙生物膜，以来自三名健康受试者的未刺激混合人类唾液作为接种物。生物膜在连续营养培养基供应下形成5天。测试装置中的生物膜每天暴露于IQOS气溶胶8次，每次5分钟。平行测试装置确保同时形成生物膜而不暴露于IQOS气溶胶，作为阴性对照。5天后，通过使用16S rRNA（16S核糖体RNA）基因的V1-V3区域进行扩增子测序，检测形成生物膜的微生物组成。此外，使用扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜。
结果一周后，无论是在IQOS气溶胶影响下还是在阴性对照中，形成生物膜的牛牙釉质样本表面均被相似覆盖。Simpson指数显示显著差异（P?<?0.05），而Pielou指数显示高度显著差异（0.01?<?P?<?0.05），Shannon指数（0.001?<?P?<?0.01）和Richness指数（P?<?0.001）也是如此。β多样性显示处理后的生物膜与阴性对照之间存在不同聚类，对应于IQOS气溶胶导致的显著不同（p?=?0.001）微生物群落。在受IQOS气溶胶影响的生物膜中，Gemella、Haemophilus、Neisseria和Rothia属的丰度显著降低。此外，不同物种的丰度也被IQOS气溶胶显著改变。
结论IQOS气溶胶可能改变口腔微生物组成，尽管不抑制生物膜生长。这突出了需要进一步研究IQOS用户对口腔微生物生态的影响，以及针对与IQOS相关的潜在健康风险制定预防和教育措施。

## 论文解读：加热不燃烧烟草气溶胶对口腔生物膜微生物组的影响

### 研究背景与问题

吸烟是全球性的重大健康问题，每年导致高达800万人过早死亡。传统可燃烟草香烟的烟雾含有大量有害物质，包括颗粒物、超过500种有机化合物及自由基，这些物质可引发人体细胞氧化应激，并增加口腔癌、牙龈炎、牙周炎、口臭及牙齿变色等口腔疾病的风险。为降低烟草消费的健康损害，非可燃尼古丁产品如加热不燃烧烟草产品（heated tobacco products, HTP）应运而生。其中，Philip Morris International于2014年在日本和意大利推出了IQOS（I Quit Ordinary Smoking），并于2019年获美国食品药品监督管理局（FDA）批准进入美国市场。IQOS通过感应加热烟弹至约350°C（远低于传统香烟的640–780°C），声称可减少有害物质排放。然而，关于IQOS气溶胶毒性的争议持续存在，研究证实其含有焦油、醛类（甲醛、乙醛）及亚硝胺等有毒物质，尽管浓度低于传统香烟烟雾。

口腔生物膜由超过700种细菌组成，在健康状态下处于互利共生稳态。环境因素如频繁糖摄入或使用消毒剂可导致口腔微生物群失调（dysbiosis），进而引发口腔疾病。吸烟是影响口腔微生物组的重要环境因素，可通过抗生素效应、缺氧、免疫系统相互作用及微环境改变等机制，改变细菌定植能力。已有研究显示，传统香烟和电子香烟气溶胶均可影响口腔微生物组成，增加龋病和牙周炎风险。然而，关于IQOS气溶胶对口腔微生物组的影响，此前尚未采用标准化方法进行研究。因此，本研究旨在利用标准化生物膜反应器，以人类混合唾液细菌为接种物，探讨IQOS气溶胶对微宇宙生物膜微生物组成的影响。该论文发表在《Clinical Oral Investigations》。

### 关键技术方法

研究人员构建了定制化的生物膜反应器，实现生物膜间歇性暴露于IQOS气溶胶。生物膜在牛牙釉质样本（表面积19.635 mm2）上形成，接种物为三名健康受试者的未刺激混合人类唾液（伦理批准号：No. 23-1537-S1-AV）。生物膜在连续营养培养基供应下培养5天，测试组每天8次（每次5分钟）暴露于IQOS气溶胶，同时设置平行阴性对照（无暴露）。通过16S rRNA（16S核糖体RNA）基因V1-V3区域扩增子测序分析微生物组成，并使用扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜形态。实验重复两次，共获得16个测序样本（测试组8个，对照组8个）。

### 研究结果

#### 扫描电子显微镜分析
SEM图像显示，IQOS气溶胶并未阻止生物膜形成。无论是否暴露于IQOS气溶胶，一周后牛牙釉质样本表面均被相似覆盖。生物膜呈现不同形态，以球菌结构为主，但也可见杆状细菌。覆盖率的定量差异未被SEM揭示。

#### 微生物多样性（α多样性）
通过InvSimpson指数、Pielou指数、Shannon指数和Richness指数评估α多样性（物种丰富度和均匀度）。结果显示，IQOS暴露组生物膜的α多样性显著低于阴性对照组：InvSimpson指数（P?<?0.05）、Pielou指数（0.01?<?P?<?0.05）、Shannon指数（0.001?<?P?<?0.01）及Richness指数（P?<?0.001）。这表明IQOS气溶胶降低了生物膜的物种丰富度和均匀度。

#### 微生物群落组成（β多样性）
基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度分析（NMDS）显示，IQOS暴露组与阴性对照组的微生物群落呈现显著不同的聚类（p?=?0.001），表明IQOS气溶胶显著改变了微生物群落结构。

#### 门、属、种水平变化
共检测到53个属和108个种，归属于7个门：Actinobacteriota（放线菌门）、Bacteroidota（拟杆菌门）、Campylobacterota（弯曲菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Fusobacteria（梭杆菌门）和Proteobacteria（变形菌门）。与阴性对照组相比，IQOS暴露组中Actinobacteriota、Bacteroidota和Fusobacteria的丰度显著降低（P?<?0.05）。在属水平，Gemella、Haemophilus、Neisseria和Rothia的丰度显著降低；此外，Eikenella、Porphyromonas和Sphingobium也表现出显著差异。在种水平，以下物种丰度显著降低（P?<?0.05）：Haemophilus parainfluenzae、Rothia mucilaginosa、Streptococcus australicus、Neisseria elongata、Sphingobium yanoikuyae、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus cristatus、Streptococcus sanguinis、Granulicatella sp.（未培养）、Porphyromonas sp.（未培养）、Eikenella sp.（未培养）及Pseudomonas sp.（未培养）。相反，Pseudomonas fuscovaginae的丰度显著增加。

### 讨论与结论

讨论部分指出，本研究采用了标准化的生物膜反应器，该设计已成功用于测试防腐剂对外源细菌整合的影响，虽不能完全模拟口腔复杂条件（如唾液成分多样），但可提供连续培养的有效模型。实验中每天8次暴露于IQOS气溶胶，反映了典型吸烟行为，但个体消费差异需进一步考虑。SEM未显示生长抑制作用，但定量方法（如结晶紫染色、菌落计数）可能提供更精确证据。与文献中传统香烟和电子香烟的研究一致，IQOS气溶胶降低了生物膜的多样性和丰富度，并减少了重要共生菌属（如Gemella、Haemophilus、Neisseria、Rothia）的丰度，这可能对口腔健康产生负面影响，尤其是硝酸盐还原菌Neisseria和Haemophilus的减少值得关注。然而，16S rRNA扩增子测序的临床意义需谨慎解读，未来应结合宏基因组测序（如鸟枪法）进行功能分析。

**研究结论**：尽管存在本体外研究的局限性，但有述明IQOS气溶胶可能对由混合人类唾液形成的微宇宙生物膜的微生物组成具有潜在调节作用，尽管生物膜生长未被抑制。然而，未来研究应评估暴露于IQOS的微生物组变化对生物膜内细菌互惠相互作用的影响，进而对细菌活力、代谢活性、产酸及总生物量的影响，以全面评估IQOS气溶胶对口腔微生物总生态的影响。这强调了需要进一步研究IQOS用户的口腔微生物组，以及针对IQOS可能的负面健康方面制定预防和教育措施。