甲状腺癌中去分化轨迹与肿瘤-间质相互作用的突变特异性动力学

《Molecular Cancer》：Mutation-specific dynamics of dedifferentiation trajectories and tumor–stromal interactions in thyroid cancer

　　

从分化型甲状腺癌向间变性甲状腺癌(ATC)的进展涉及深刻的上皮可塑性与肿瘤微环境(TME)重塑，但BRAFV600E和RAS驱动突变如何塑造这些过程尚不清楚。在此，研究人员整合了单核RNA测序(snRNA-seq)、空间转录组学和批量RNA测序(bulk RNA-seq)，涵盖BRAFV600E和RAS驱动的甲状腺肿瘤，以描绘突变特异性的进展轨迹。BRAFV600E驱动的肿瘤表现出伴有免疫通路激活的渐进性去分化轨迹，而RAS驱动的肿瘤则显示出以非整倍体、上皮-间质转化(EMT)、缺氧和细胞外基质(ECM)重塑为特征的突发性转变。癌症相关成纤维细胞(CAFs)成为关键调节因子，具有突变特异性的配体-受体相互作用：整合素(integrin)为基础的信号传导在BRAFV600E突变的ATC中占主导，而PLAU–PLAUR、TNFSF10–TNFRSF10B和AREG–EGFR在RAS驱动的ATC中额外富集。这些CAF-上皮回路在空间上得到了验证，并与不良预后相关。总之，研究人员的发现揭示了与甲状腺癌去分化相关的依赖于突变的上皮和TME动力学，并强调了分子定制方法在晚期甲状腺癌管理中潜在的的重要性。

该研究发表于《Molecular Cancer》。目前甲状腺癌(TC)进展从分化型甲状腺癌(DTC)去分化为高侵袭性的间变性甲状腺癌(ATC)的过程中，上皮可塑性与肿瘤微环境(TME)重塑的关键作用虽被单细胞及空间转录组学阐明，但致癌突变尤其是BRAF^V600E样与RAS样肿瘤对这些过程的差异化影响仍不明确，既往研究多未依突变亚型分层聚焦乳头状甲状腺癌(PTC)，且晚期去分化肿瘤对常规疗法及突变特异性酪氨酸激酶抑制剂疗效有限，分子细胞异质性导致治疗反应差异大，亟需解析突变特异性的进展机制以指导分子定制策略。研究人员整合单核RNA测序(snRNA-seq)、空间转录组学（10x Visium及GeoMx DSP）与批量全转录组测序(WTS)，对BRAF^V600E突变PTC及对应ATC、RAS突变滤泡状甲状腺癌(FTC)及对应ATC共16例新鲜冷冻组织及20例FFPE空间样本开展多模态分析，并结合311例公共WTS、94例公共scRNA-seq及外部空间数据集进行验证，旨在定义突变特异性的上皮进展轨迹及其与TME的协调互作。

作者开展研究用到的主要关键技术方法包括：样本来源于16例内部BRAF^V600E/RAS驱动的分化型与间变性甲状腺癌组织及311例公共数据库甲状腺癌转录组样本；采用单核RNA测序(snRNA-seq)与批量RNA测序(WTS)解析细胞转录谱与基因组变异（全基因组测序WGS推断体细胞突变与拷贝数变异CNV）；运用10x Visium与GeoMx DSP空间转录组学进行空间细胞解卷积与配体-受体共定位分析；借助Monocle进行上皮伪时序轨迹分析，CellPhoneDB与STopover分别推断细胞-细胞通讯与空间拓扑共定位；通过免疫组化(IHC)在组织芯片上验证关键互作分子蛋白表达；利用Cox比例风险模型与生存分析评估上皮亚型及互作分子的临床预后关联。

研究结果部分保留小标题并简述如下：

基因组与批量转录组特征揭示BRAF^V600E与RAS驱动甲状腺癌去分化的基础。研究人员通过WGS与WTS分析发现，ATC-B/R多携带TERT启动子(TERTp)与TP53共突变，非侵袭性PTC-B/FTC-R无TERTp，侵袭性AG/HG亚型均含TERTp；RAS驱动肿瘤结构变异与基因融合更频发，线粒体DNA(mtDNA)突变主要影响复合物I且多见于BRAF^V600E肿瘤。转录组上PTC-B甲状腺分化评分(TDS)低、ERK激活高，ATC-R的TDS显著低于ATC-B且ERK更高；ESTIMATE算法显示PTC-B免疫与基质评分高于FTC-R，进展为ATC后上皮评分降低而免疫基质升高，ATC-B更显著；通路分析示ATC-R血管生成、EMT、炎症通路强激活，RAS驱动肿瘤去分化呈突发转变，BRAF^V600E则以TME重塑为主。

单细包与空间分析解析BRAF^V600E与RAS驱动去分化的生态系动态。snRNA-seq鉴定102845个细胞为上皮、T/NK、髓系、成纤维、内皮五大类，ATC中上皮细胞减少而TME细胞增加，两突变型ATC的TME组成趋同；混合效应模型示TDS与RAS肿瘤上皮及内皮比例正相关，ERK与BRAF^V600E肿瘤髓系成纤维富集相关，RAS中亦关联T/NK增加；空间转录组见ATC区免疫与成纤维细胞富集，证实进展中TME转变。

去分化中上皮细包异质性依突变状态不同。上皮无偏聚类为7亚型：DTC-TDS_high1/2、DTC-TDS_mid1/2、DTC-TDS_low、ATC-ERK_low、ATC-ERK_high；ATC-ERK_high非整倍体最多、TDS最低、EMT炎症特征最强。空间解卷积示BRAF^V600E肿瘤DTC-TDS_mid2/low分布于PTC与ATC区并与高分化亚型共聚类，RAS肿瘤DTC-TDS_mid2/low仅限ATC区且无高分化细胞，提示不同发病机制；生存分析示高比例TDS_high1/2、TDS_mid1预后好，TDS_low与ATC-ERK_high最差。

BRAF^V600E与RAS驱动向ATC去分化的通路动力学差异。伪时序分析以高TDS细胞为起点分出ATC^B/HG^B与ATC^R/HG^R支；BRAF^V600E沿连续去分化轨迹逐步丧失分化、免疫通路渐进激活，两分支异质性强但通路相似，ATC^B免疫更显；RAS的HG^R均一似基底态，ATC^R突发转为ATC-ERK_low继以ATC-ERK_high，非整倍体骤增，EMT缺氧ECM通路剧变，空间轨迹验证上述转变。

ATC进展中BRAF^V600E与RAS驱动的差异化上皮-TME互作。CellPhoneDB示DTC到ATC细胞互作剧增，PTC-B强于FTC-R，ATC-R远强于ATC-B；所有ATC中上皮-成纤维互作主导增强，BRAF^V600E除DTC-TDS_mid外各上皮亚型ATC期互作升，RAS所有亚型ATC期均增强且ATC-ERK_low/high最著；空间邻域富集与Jaccard指数验证ATC区成纤维与上皮紧密共定位，RAS肿瘤互作增幅更大。

ATC进展中癌症相关成纤维细胞(CAFs)动态演变。成纤维分为炎症型iCAF（标记DCN）与肌成纤维myoCAF（标记RGS5）；FTC-R的CAF最少以myoCAF为主，PTC-B两型均衡，进展ATC后iCAF剧增且活化评分升高；ATC-CAFs富集ECM重塑、创伤愈合、炎症与上皮增殖迁移程序，而非DTC-CAF的结构功能。

ATC进展中BRAF^V600E与RAS驱动的差异化CAF-上皮互作。配体-受体分析结合空间共定位示ATC-B以黏附迁移相关L1CAM–ITGAV、THBS1–ITGB1及TNC–整合素复合体为主；ATC-R额外富集PLAU–PLAUR、TNFSF10–TNFRSF10B、AREG–EGFR，对应EMT缺氧应激程序；网络分析ATC-B连黏附免疫EMT，ATC-R增缺氧凋亡EGFR/TGFβ信号；空间与GeoMx示共定位区对应通路激活强，高配受体表达预后差；IHC验证ATC中L1CAM、ITGAV、PLAU、PLAUR上调且具突变与区室特异性，snRNA-seq示L1CAM在上皮、ITGAV在CAF，PLAU/PLAUR二者均升。

讨论部分总结：研究人员通过多模态分析阐明BRAF^V600E与RAS突变差异化塑造上皮状态、TME互作及ATC去分化轨迹；BRAF^V600E呈连续渐进去分化伴免疫激活与纤维互作强化，RAS呈突发阶跃转变伴ECM重塑缺氧与非整倍体激增，临床行为对应早期浸润免疫 engaged与惰性突发恶化；CAFs为双突变ATC进展核心，ATC中iCAF增多活化，BRAF^V600E主整合素信号，RAS扩PLAU–PLAUR等轴，提供潜在干预靶点；研究填补TC演化生物学空白，揭示晚期TC生物学异质性与分子定制策略依据。研究结论翻译为：通过单核RNA测序、空间转录组学与批量WTS的整合分析，我们阐明了BRAF^V600E和RAS突变如何差异化塑造上皮细胞状态、TME相互作用及导致ATC的去分化轨迹。我们的多模态框架揭示了不同的突变特异性进化路径；BRAF^V600E驱动的TC遵循更连续的去分化连续谱，而RAS驱动的TC经历以ECM重塑和缺氧相关通路激活为特征的突发阶跃转变。尽管存在差异，CAFs在BRAF^V600E和RAS驱动的TC的ATC进展中均成为核心角色，促进EMT、免疫逃逸与肿瘤侵袭。独特的配体-受体程序，如BRAF^V600E突变TC中的整合素介导信号及RAS突变肿瘤中扩展的PLAU–PLAUR、TNFSF10–TNFRSF10B和AREG–EGFR轴，表明CAFs通过突变特异性机制影响肿瘤进展，强调了其用于靶向干预的潜力。由于这些预测基于基因表达推断，未来功能研究对确定这些CAF-上皮回路是否足以驱动ATC进展至关重要。