《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Mutant Huntingtin disrupts neurogenic and astroglial programs via the EZH2–Let-7g–LIN28 axis with rescue by epigenetic modulators
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摘要 突变亨廷顿蛋白（mutant huntingtin，mHTT）在亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）中驱动发病机制的分子机制仍未完全阐明。在此，研究人员表明，在啮齿动物和人类神经干细胞（neural stem cell，NSC）的H
摘要 突变亨廷顿蛋白（mutant huntingtin，mHTT）在亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）中驱动发病机制的分子机制仍未完全阐明。在此，研究人员表明，在啮齿动物和人类神经干细胞（neural stem cell，NSC）的HD模型中，神经发生在谱系进展的多个阶段均受到破坏。研究人员识别出一种此前未被认识的表型，其特征为早期多能祖细胞的异常扩增，以及伴随的星形胶质细胞生成（astrogliogenesis）的深刻缺陷，即HD星形胶质细胞未能表达胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。从机制上讲，这一缺陷源于涉及EZH2和LIN28上调以及成熟let-7g微小RNA（microRNA，miRNA）表达降低的表观遗传调控轴（epigenetic regulatory axis）的失调。针对该通路不同节点（通过EZH2调控、let-7g恢复或LIN28抑制）的表观遗传药理学干预，挽救了人类HD细胞的星形胶质细胞分化，并改善了果蝇HD模型中的运动功能。研究人员的发现表明，mHTT可能触发双相星形胶质细胞衰竭：早期发育损伤，随后是再生性胶质细胞生成（regenerative gliogenesis）的崩溃。这种双峰机制（bimodal mechanism）提出星形胶质细胞功能障碍是HD发病机制的核心驱动因素。最后，研究人员确定了一组临床相关的表观遗传化合物，这些化合物通过作用于该轴内的不同靶点，有望成为能够改变疾病进程的跨阶段治疗策略。
论文解读文章
1. 研究背景与研究目的
亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）是一种进行性神经退行性疾病，主要影响运动、认知和精神功能。其病因是HTT基因中CAG三核苷酸重复序列的异常扩增，导致突变亨廷顿蛋白（mutant huntingtin，mHTT）的表达。mHTT通过与超过350种细胞靶点相互作用，破坏多种细胞过程，其中中枢神经系统（central nervous system，CNS）受影响最为严重。尽管纹状体中型多棘神经元（medium spiny GABAergic neurons）的变性是HD的典型病理特征，但越来越多的证据表明，胶质细胞功能障碍，尤其是星形胶质细胞的功能障碍，在HD发病机制中扮演着关键角色。星形胶质细胞功能异常表现为谷氨酸转运体表达降低、谷氨酸清除受损，以及代谢支持和突触调控障碍等。
值得注意的是，有证据表明CNS损伤在临床症状出现前数十年就已开始，早期发育障碍可能在其中发挥作用。过去的研究已发现，mHTT可破坏神经元迁移、阻碍少突胶质细胞成熟，甚至影响神经干细胞（neural stem cell，NSC）的活性。例如，HD患者脑室下区（subventricular zone，SVZ）的扩增已在尸检中被观察到。尽管如此，关于mHTT对早期星形胶质细胞发育及星形胶质细胞生成（astrogliogenesis）影响的研究仍然不足。鉴于星形胶质细胞在HD病理中的核心作用及其发育性改变的相关知识有限，研究人员开展了此项研究，旨在探究mHTT如何改变神经发生（neurogenesis），特别是其对早期神经前体细胞和星形胶质细胞生成的影响。
2. 研究方法
研究人员采用了多种关键技术方法以实现研究目标。首先，研究使用了zQ175敲入小鼠模型（表达含约190个CAG重复的全长mHTT）及来自三名携带不同CAG重复数（43、64、85）的HD患者的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）来源的人神经干细胞（human neural stem cell，hiNSC）。其次，通过免疫组织化学、共聚焦显微镜和细胞培养技术分析了SVZ区NSCs的增殖、自我更新及分化能力。再次，利用基因表达芯片（GeneChip Human Transcriptome Array，HTA）2.0进行了全转录组分析，并通过染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）与实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术检测了组蛋白修饰和转录因子结合。此外，研究人员使用了Tazemetostat（TAZ）、MS1943、IPA3和1632等小分子化合物进行药理干预，并在果蝇（Drosophila）HD模型中验证了体内效果。
3. 研究结果
**SVZ来源的zQ175 NSCs表达mHTT，表现出失调的自我更新、增殖增加和分化改变**
通过分析出生后第7天（postnatal day 7，P7）的zQ175小鼠SVZ，研究人员发现在其神经干细胞生态位中存在增殖缺陷，表现为增殖细胞（Ki67阳性）数量显著增加，尤其是在瞬时扩增的MASH1阳性（ASCL1阳性）C型祖细胞群体中。在体外培养的zQ175小鼠NSCs（zQ175-mNSCs）中，总的细胞增殖能力显著增强，但克隆效率未见改变，这进一步证实了mHTT主要影响下游的瞬时扩增祖细胞。分化实验表明，与野生型相比，zQ175-mNSCs生成的神经元数量减少，但神经突长度增加；少突胶质细胞比例增加；而最显著的表型是GFAP阳性星形胶质细胞数量显著减少。这些发现提示，mHTT在早期就干扰了神经发生的多个阶段，其中C型祖细胞的过度增殖和星形胶质细胞分化失败是突出表型。
**扩增的polyQ亨廷顿蛋白影响iPSC来源的hiNSCs的形态和增殖**
为了验证上述发现是否在人类细胞中保守，研究人员分析了三名HD患者的hiNSCs。在hiNSC阶段，HD细胞系表现出形态学差异，形成直径显著增大的神经球，其中含有深色胞内包涵体。与小鼠模型一致，HD-hiNSCs显示出增殖加速，Ki67阳性细胞比例更高，扩增速率更快，但细胞死亡率和克隆形成指数未改变。
**亨廷顿病hiPSC来源的神经干细胞中星形胶质细胞分化的异常**
分化诱导后，HD-hiNSCs生成的神经元更少，且神经元形成异常的3D簇状结构，神经突生长无序。同时，少突胶质细胞比例升高。与之相对，HD-hiNSCs分化出的GFAP阳性星形胶质细胞比例在所有三株患者细胞系中均显著降低，这通过免疫荧光、免疫印迹和qRT-PCR等多种方法得到验证。这种分化缺陷在将HD-hiNSCs移植到免疫缺陷小鼠纹状体后同样被观察到，表明其非体外培养特异性表型。转录组分析进一步证实，HD-hiNSCs中与星形胶质细胞和少突胶质细胞前体（oligodendrocyte precursor cell，OPC）发育相关的基因显著下调。
**HD NSCs中表观遗传效应因子EZH2的上调**
研究人员在HD-hiNSCs和zQ175-mNSCs中均发现，编码多梳抑制复合体2（polycomb repressive complex 2，PRC2）催化亚基的EZH2基因在转录和蛋白水平上均显著上调，且其酶活性增强。ChIP实验显示，在HD-hiNSCs中，GFAP启动子区域（尤其是-4.6 kb位点）的H3K27me3抑制性组蛋白修饰显著富集，且EZH2蛋白在该区域结合增多，表明EZH2通过沉积H3K27me3直接抑制GFAP转录。
**抑制EZH2不影响自我更新但影响增殖和星形胶质细胞分化**
使用药理学抑制剂Tazemetostat（TAZ，EZH2甲基转移酶活性抑制剂）和MS1943（EZH2选择性降解剂）处理HD-hiNSCs。在非毒性浓度下，两种药物均能减少HD-hiNSCs的增殖（但不影响克隆效率），并能显著恢复星形胶质细胞分化途中GFAP蛋白的表达水平（通过免疫荧光和免疫印迹确认）。这说明EZH2的过度活跃在HD神经发育缺陷中发挥了因果性作用。
**LIN28在HD-hiNSCs中上调并损害Let-7g成熟，从而维持EZH2 mRNA水平**
研究发现，与对照组相比，HD-hiNSCs中成熟的let-7g miRNA水平显著降低。LIN28蛋白作为let-7加工的已知抑制因子，其在HD-hiNSCs中的mRNA和蛋白水平均显著上调。这提示，病理性的LIN28高表达抑制了let-7g的成熟，从而解除了let-7g对EZH2 mRNA的降解作用，导致EZH2蛋白积累。使用何干扰该轴线的药物（如抑制末端尿苷酸转移酶TUTase的IPA3，或抑制LIN28与pre-let-7结合的化合物1632）处理，均可恢复let-7g水平，并挽救HD-hiNSCs中GFAP阳性的星形胶质细胞分化缺陷。
**表观遗传调节剂改善亨廷顿病果蝇模型的运动功能**
在果蝇HD模型中，研究人员检测到Ezh2和Lin28同源基因的转录本上调。给表达突变HTT蛋白的果蝇喂食TAZ、MS1943、IPA3或1632，在发育期及成年期持续给药。与对照组相比，所有四种化合物均显著改善了HD果蝇的攀爬能力，而不会影响表达野生型HTT的对照果蝇的运动性能，说明这些药物在体内具有特异性的神经保护作用，能够改善mHTT诱导的运动功能障碍。
4. 讨论与结论
本研究的讨论部分指出，通过在转基因HD小鼠模型和患者iPSC来源的hiNSCs中研究神经发生，研究人员证明了mHTT破坏了多能神经祖细胞的功能完整性，导致其过度增殖并伴随星形胶质细胞生成的缺陷。这种异常表型与EZH2的上调相关，后者又与let-7g miRNA水平降低和LIN28蛋白水平升高有关。重要的是，对EZH2–let-7g–LIN28轴的药理学调节，不仅能减轻异常的祖细胞增殖和恢复GFAP表达，也能改善果蝇HD模型的运动功能障碍。
研究人员讨论了一个关键问题：尽管在模型系统中观察到GFAP表达降低，但在HD患者或动物模型的大脑（甚至成人）中通常报告GFAP表达不变或增高（被认为是反应性星形胶质增生）。为了调和这种矛盾，论文提出了一个概念框架：GFAP表达缺陷可能在发育早期就已存在，但由于其他中间丝蛋白（如vimentin）的代偿性表达而保持表型沉默；随着疾病进展，星形胶质细胞发生反应性转化，导致GFAP表达升高，这可能是“终末状态”的反应，从而掩盖了早期的缺陷。因此，研究人员的发现指向了一个模型，即早期星形胶质细胞谱系的扰动建立了潜在的脆弱性，并在整个病程中逐渐显现，最终可能加剧疾病发展。
研究结论部分转录如下：总而言之，研究数据支持一个机制模型，其中突变亨廷顿蛋白（mutant huntingtin，mHTT）通过促进早期多能神经祖细胞的扩增并损害其向星形胶质细胞的分化，从而破坏神经发育程序。这些效应至少部分是由EZH2活性增加介导的，而EZH2活性的增加源于LIN28的上调以及随之而来的对Let-7g微小RNA（microRNA，miRNA）成熟的抑制。由于Let-7g通常会抑制EZH2 mRNA，其下调导致EZH2表达持续存在，并增强了H3K27me3介导的对星形胶质细胞分化关键基因的抑制。针对该通路的药理学干预，无论是通过抑制EZH2酶活性、去稳定EZH2蛋白，还是增强Let-7g成熟，都能有效恢复HD-hiNSCs的增殖能力和星形胶质细胞分化。值得注意的是，靶向该表观遗传轴的治疗潜力在体内通过改善128Q果蝇相较于16Q对照果蝇的运动性能得到了进一步验证。总的来说，这些发现揭示了亨廷顿病中mHTT介导的神经发育缺陷的一个新颖且可成药的（druggable）表观遗传机制。
