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演化发育生物学（evo-devo）通过整合比较形态学、分子遗传学和演化理论，解释了植物的起源与多样化，从而革新了植物分类学。基因编辑领域的最新进展，特别是基于CRISPR/Cas的技术，进一步加速了从描述性分类学到发育与演化假设实验验证的转变。本综述探讨了CR
演化发育生物学（evo-devo）通过整合比较形态学、分子遗传学和演化理论，解释了植物的起源与多样化，从而革新了植物分类学。基因编辑领域的最新进展，特别是基于CRISPR/Cas的技术，进一步加速了从描述性分类学到发育与演化假设实验验证的转变。本综述探讨了CRISPR/Cas9、Cas12a、碱基编辑（base editing）和引物编辑（prime editing）在解析植物形态演化、功能同源性和物种多样化的遗传机制中的新兴作用。文章强调了多重基因组编辑如何克服多倍体物种中的基因冗余，使得同时修饰多个同源基因（homoeologous genes）成为可能，从而促进亚功能化（subfunctionalization）、新功能化（neofunctionalization）和适应性性状演化的研究。基因组编辑与单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）、空间基因组学（spatial genomics）和细胞器基因组（organelle genome）研究的整合，为重建发育路径和祖先性状提供了前所未有的分辨率，同时解决了长期存在的分类学模糊性。此外，对调控元件和发育基因的精确编辑提供了连接基因型与表型的直接实验证据，从而加强了系统发育推断和分类。尽管取得了这些进展，脱靶效应（off-target effects）、基因型依赖性（genotype dependence）、转化效率低（transformation inefficiency）、非模式物种参考基因组有限（limited reference genomes for non-model species）以及监管问题（regulatory concerns）等挑战仍然制约着广泛应用。新兴策略，包括改进的引导RNA设计（guide RNA design）、无转基因编辑（transgene-free editing）和纳米颗粒介导的递送（nanoparticle-mediated delivery），有望克服这些限制。总体而言，基因编辑与evo-devo的整合为推进植物演化、分类学和生物多样性研究提供了一个强大的框架。
1 Introduction
引言介绍了演化发育生物学（evo-devo）的目标，即解释进化过程如何影响生物体发育和新生物形态的形成。CRISPR/Cas9系统作为最强大的基因编辑技术，由Cas9蛋白、反式激活crRNA（tracr-RNA）和CRISPR RNA（crRNA）组成。此外，CRISPR/Cas12a（Cpf1）系统与Cas9的区别在于：识别T-rich PAM序列（TTTN或TTN），产生5
’粘性末端（5-nt 5
’ overhangs），且不需要tracrRNA即可加工自身crRNA。多倍体中的基因冗余是研究植物evo-devo和分类学的核心问题，而CRISPR多重编辑通过利用多个单引导RNA（sgRNAs）靶向并突变多个同源基因（homoeologous genes），可有效解析剂量平衡效应，并追踪重复基因家族（如MADS-box调节因子）的进化命运（如假基因化、亚功能化、新功能化）。尽管存在脱靶效应、基因型依赖性、转化效率等挑战，但改进sgRNA设计、使用Cas9变体和核糖核蛋白复合物（RNPs）等无转基因递送方法正在被开发。
2 Foundations of evo-devo in plant taxonomy
进化发育生物学（evo-devo）通过整合比较形态学和分子遗传学，在系统发育框架内阐明驱动表型多样性的调控机制，从而重塑了植物系统学。同源性（homology）概念从经典的刚性“要么/要么”分类转向动态的多层次部分同源性和发育连续体。关键发育途径变化包括异时性（heterochrony）、异位性（heterotopy）和同源异型（homeosis），这些通常反映在MADS-box等保守调控基因的改变。通过将基因表达模式映射到进化树上，研究人员可有效区分祖先状态与趋同进化。这种以过程为导向的方法为现代分类学提供了基于数据的预测性框架。
2.1 Gene editing as a tool for evo-devo studies
基因编辑技术，特别是CRISPR-Cas系统，已将演化发育生物学（evo-devo）从描述性学科转变为实验性科学。通过精确的敲除或敲入修饰，研究人员可直接评估驱动形态适应的遗传机制。CRISPR系统通过易设计的单引导RNA（sgRNA）提供前所未有的精度和效率，而DNA-free预组装核糖核蛋白（RNPs）加速了植物研究。此外，单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（spatial transcriptomics）与CRISPR结合，可在高分辨率下捕获细胞轨迹、转变和发育程序，克服传统方法丢失空间背景的问题，从而揭示特定突变如何改变细胞异质性并重写局部基因调控网络。
3 Revisiting morphological characters through editing
现代基因编辑技术使比较形态学从描述性转向功能性科学，允许研究人员实验性检验关于结构发育和进化历史的长期假设，例如通过在不同物种中敲除候选基因来澄清部分同源性和形态异常的争论。通过分离特定物理性状（如牛PRLR基因突变影响毛皮和体温调节），基因编辑允许解耦形式与功能，并可工程化推定的祖先基因序列来模拟过渡表型（如鸟类恐龙样前肢）。因为主要解剖差异常源于调控元件的时间和空间表达变化，精确靶向增强子和启动子揭示了微小调控变化如何产生宏观进化物理多样性。基因编辑挑战了刚性的类型学分类，通过引入功能同源性（functional homology）的复杂概念，区分了由共同祖先保留的结构和趋同类比。
4 Ancestral trait reconstruction via editing
祖先性状重建（ATR）利用计算系统发育学推断灭绝共同祖先的特征（序列、基因或表型），而CRISPR-Cas9技术使研究人员能在体内实验创建和验证这些祖先性状。通过最大似然或贝叶斯推断等进化模型，从现存后代推断古代DNA或蛋白质序列，然后工程化到现存活体生物中，以实验“复活”祖先表型。这一功能验证允许分离中间进化步骤，精确定位负责古代适应（如祖先酶的热稳定性增强）的氨基酸残基或遗传变异。将ATR扩展到植物细胞器（叶绿体和线粒体）基因组，可实验复活假设的祖先细胞器性状，验证诊断性序列变异，并揭示核心代谢过程（如光合作用）如何驱动环境适应，以及历史细胞内基因转移事件。
5 Resolving botanical homology through precision genome editing
通过CRISPR/Cas9敲除非模式谱系中的TCP和MADS-box基因，实证验证了宏观进化花部创新（如两侧对称花型）的遗传基础，直接确认了调控网络变化如何驱动花部结构分化。在复杂多倍体油菜（Brassica napus）中，多重CRISPR阵列靶向JAGGED基因，系统解析了亚功能化并绘制了其在叶和果实形态变异中的精确作用。此外，破坏茄科（Solanaceae）物种果实结构的顺式调控元件，证明了启动子区域的靶向突变可复制跨进化支的过渡表型。这些实证突破从预测视角转向实证验证，解决了关于植物同源性和特征演化的历史争议。
6 Implications for biodiversity and conservation
先进的基因编辑方法包括通过非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）的靶向诱变，以及碱基编辑（BE）和引物编辑（PE）。标准CRISPR-Cas9通过sgRNA在PAM位点诱导双链断裂，但通过设计PAM变异Cas9变体和发现天然同源物（如SaCas9和FnCas9）拓展了靶向范围。对于多基因evo-devo研究，Cas12a和Cas12b通过识别T-rich PAM、处理自身crRNA阵列和产生交错末端实现高效多重编辑。碱基编辑平台（包括胞嘧啶碱基编辑器CBE、糖基化酶碱基编辑器GBE和腺嘌呤碱基编辑器ABE）通过将脱氨酶融合至切口酶Cas9（nCas9）实现精准碱基转换而不诱导双链断裂。引物编辑（PE）利用引物编辑引导RNA（pegRNA）和工程化逆转录酶，在基因组原位实现定制化插入、缺失或点突变。这些工具允许在野生、濒危或系统发育孤立物种中重建、沉默或修饰特征相关基因，为非模式植物研究提供实证见解。
6.1 Challenges and future prospects
尽管基因编辑技术潜力巨大，但在植物系统中仍面临技术瓶颈。细胞器基因组编辑困难，因为病原体递送试剂进入双膜结构并应对活跃的同源重组途径极具挑战。克服递送限制需要优化组织特异性非病毒载体，如纳米颗粒或细胞器靶向肽。非模式植物缺乏注释的参考基因组、存在基因组嵌合体和脱靶突变风险。未来需整合高精度工具（如碱基编辑和引物编辑）与人工智能和多组学建模，以解析复杂多基因性状而不产生灾难性双链断裂。此外，植物转化和组织培养是严重瓶颈，使用发育调控因子如BABY BOOM（BBM）、WUSCHEL（WUS）和GROWTH-REGULATING FACTOR-GIF（GRF-GIF）复合物可显著提高再生效率并扩展可编辑的基因型范围。缺乏染色体级参考基因组阻碍sgRNA设计和多重编辑策略。未来需整合泛基因组测序和免组织培养递送方法（如纳米技术或花粉磁转染），以将基因编辑转化为常规分类学验证工具。
7 Conclusion
先进基因组编辑平台与演化发育生物学的融合建立了变革性的过程驱动范式，将植物分类学从描述性分类系统提升为实验性科学。通过部署精确的CRISPR-Cas9/Cas12a系统、碱基编辑器和引物编辑器，并结合发育调控因子以克服非模型物种的顽拗性，研究人员可直接解析关键诊断性状的遗传架构。通过多重gRNA靶向，这一整合的“Evo-Devo-Taxonomy”框架成功绕过多倍体中的基因组冗余，揭示重复基因家族的进化轨迹，同时澄清了关于部分同源性和形态异常的长期争议。此外，将精确的顺式调控和细胞器修饰与单细胞转录组学结合，允许系统验证系统发育预测、重建祖先状态并绘制单细胞分辨率的细胞轨迹。最终，通过将分类学焦点从静态成体形态转向驱动多样化的动态发育机制，这一新兴方法调和了表型变异与分子系统发育之间的历史冲突，为准确映射和概念化植物生命树的分支提供了坚实的过程驱动框架。
