一种用于检测牛病毒性腹泻病毒1型的RT-RAA-CRISPR/Cas12a荧光检测方法的开发

《BMC Veterinary Research》：Development of an RT-RAA-CRISPR/Cas12a fluorescent detection method for the detection of bovine viral diarrhea virus 1

　　

摘要

背景

牛病毒性腹泻病毒是一种可能导致繁殖障碍、健康问题及生产性能下降的病毒病原体。由于持续的基因多样性，BVDV的不同血清型不断发生变化，尤其是BVDV1，这使得诊断检测方法的特异性和灵敏度受到影响。此外，BVDV1在全球范围内广泛存在，给畜牧业造成了巨大损失。因此，为进一步控制并消除BVDV，有必要检测并防止其传播，这就需要建立更快、更准确的现场检测方法。

方法

传统的PCR和ELISA方法存在成本高、灵敏度有限以及依赖专用设备等问题。在本研究中，我们基于BVDV1保守的5’非翻译区设计了引物，进而开发出一种结合一步逆转录重组酶辅助扩增技术与CRISPR/Cas12a荧光底物的检测方法，该技术能够快速筛查并准确区分BVDV1，同时用于诊断和区分牛冠状病毒、牛疱疹病毒1型等其他常见牛源病毒。所建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测体系可在40℃的便携式金属浴中完成整个检测过程。我们进一步优化了该技术的反应条件，以提升其灵敏度、特异性和重复性。随后使用该技术和传统PCR对300份牛临床样本进行了检测，以验证其实际检测效果。

结果

该方法与其他九种常见牛源病毒无交叉反应，显示出极高的特异性。在不进行RT-RAA扩增的情况下，引发显著转录切割反应所需的最低模板浓度为10拷贝/μL的BVDV模板；而结合RT-RAA扩增后，检测限可显著降低至每反应1拷贝的BVDV模板。在模拟样本测试中，该方法的准确率为100%，且整个检测过程可在30分钟内完成。在临床样本测试中，RT-RAA-CRISPR/Cas12a对BVDV1的检测灵敏度更高，其阳性检出率是传统PCR的1.85倍。

结论

总之，本研究建立的BVDV-1 RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法具有操作快速、灵敏度高、靶向性强且重复性好等优点。此外，由于采用相同的试管反应体系，该技术可在资源匮乏的环境中广泛应用，因此在BVDV疫情爆发时的大规模筛查中具有重要价值。这一方法不仅丰富了BVDV的诊断手段，也为控制牛群中BVDV的传播提供了新的有效解决方案。

图形摘要

背景

牛病毒性腹泻病毒是一种可能导致繁殖障碍、健康问题及生产性能下降的病毒病原体。由于持续的基因多样性，BVDV的不同血清型不断发生变化，尤其是BVDV1，这使得诊断检测方法的特异性和灵敏度受到影响。此外，BVDV1在全球范围内广泛存在，给畜牧业造成了巨大损失。因此，为进一步控制并消除BVDV，有必要检测并防止其传播，这就需要建立更快、更准确的现场检测方法。

方法

传统的PCR和ELISA方法存在成本高、灵敏度有限以及依赖专用设备等问题。在本研究中，我们基于BVDV1保守的5’非翻译区设计了引物，进而开发出一种结合一步逆转录重组酶辅助扩增技术与CRISPR/Cas12a荧光底物的检测方法，该技术能够快速筛查并准确区分BVDV1，同时用于诊断和区分牛冠状病毒、牛疱疹病毒1型等其他常见牛源病毒。所建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测体系可在40℃的便携式金属浴中完成整个检测过程。我们进一步优化了该技术的反应条件，以提升其灵敏度、特异性和重复性。随后使用该技术和传统PCR对300份牛临床样本进行了检测，以验证其实际检测效果。

结果

该方法与其他九种常见牛源病毒无交叉反应，显示出极高的特异性。在不进行RT-RAA扩增的情况下，引发显著转录切割反应所需的最低模板浓度为10拷贝/μL的BVDV模板；而结合RT-RAA扩增后，检测限可显著降低至每反应1拷贝的BVDV模板。在模拟样本测试中，该方法的准确率为100%，且整个检测过程可在30分钟内完成。在临床样本测试中，RT-RAA-CRISPR/Cas12a对BVDV1的检测灵敏度更高，其阳性检出率是传统PCR的1.85倍。

结论

总之，本研究建立的BVDV-1 RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法具有操作快速、灵敏度高、靶向性强且重复性好等优点。此外，由于采用相同的试管反应体系，该技术可在资源匮乏的环境中广泛应用，因此在BVDV疫情爆发时的大规模筛查中具有重要价值。这一方法不仅丰富了BVDV的诊断手段，也为控制牛群中BVDV的传播提供了新的有效解决方案。

图形摘要