新西兰本土牛鱼（Gobiomorphus cotidianus）的淋巴囊肿病

《Journal of Fish Diseases》：Lymphocystis Disease in Endemic Aotearoa New Zealand Bully (Gobiomorphus cotidianus)

　　

研究人员首次在新西兰（Aotearoa New Zealand）淡水环境中从一尾常见牛鱼（toitoi，Gobiomorphus cotidianus（塘鳢科））个体中检测到淋巴囊肿病病毒（lymphocystis disease virus, LCDV）。Dinah's牛鱼（Gobiomorphus dinae）和Kaharore牛鱼（Gobiomorphus mataraerore）也表现出明显的鳍部结节性病变，但未进行采样。对G. cotidianus结节性病变的组织病理学检查显示肥大的淋巴囊肿细胞，具有厚的透明囊膜和胞浆内包涵体。使用靶向主要衣壳蛋白（major capsid protein, MCP）基因的引物进行DNA检测，淋巴囊肿病病毒呈阳性。对LCDV基因型I（物种LCDV1的同义词）、基因型LCDV II和LCDV III（来自韩国和日本未分类LCDV物种的同义词）检测为阴性，而与基因型LCDV IV（在中国、台湾和韩国发现的未分类LCDV-RC和SB98Yosu物种的同义词）亲缘关系最近。这表明可能涉及一种新型新西兰变种。这项研究提供了来自新西兰的首个LCDV基因序列，有助于全球范围内识别野生淋巴囊肿病的努力。某些牛鱼物种是双向洄游的，这为LCDV在淡水、河口和海洋环境中的传播提供了机会。

### 论文解读：新西兰本土牛鱼（Gobiomorphus cotidianus）淋巴囊肿病的首次分子鉴定

#### 研究背景与问题

淋巴囊肿病（lymphocystis disease, LCD）是由淋巴囊肿病病毒（lymphocystis disease virus, LCDV）引起的一种慢性病毒性疾病，该病毒属于虹彩病毒科（Iridoviridae）的淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus）。LCDV可通过水体传播，经皮肤或鳃进入宿主，在鳍、皮肤甚至内脏形成单个或多个结节性病变，其外观类似菜花样。该病通常呈良性，但在圈养环境中，大量结节可抑制生理机能，并继发细菌和寄生虫感染导致死亡。全球已知LCDV感染超过150种养殖和野生鱼类，但在新西兰，该病的记录极为稀缺。此前，仅有两例针对进口观赏鱼的组织学诊断报告（Durham and Anderson, 1981），以及三例针对野生海鱼（如John Dory和parore）的疑似记录，但缺乏分子数据。新西兰淡水环境中从未报道过LCDV，且本土鱼类是否受到该病毒威胁完全未知。鉴于新西兰许多淡水鱼类因污染、栖息地丧失和外来物种引入而处于濒危状态，疫病的出现可能进一步加剧这些物种的风险。因此，研究人员旨在通过多种诊断技术（细胞学、组织病理学、PCR和测序）确认新西兰常见牛鱼（Gobiomorphus cotidianus）中类似淋巴囊肿的病变，并利用主要衣壳蛋白（major capsid protein, MCP）基因进行系统发育分析，以确定新西兰毒株在全球已知LCDV基因型和物种中的分类地位。该研究发表在《Journal of Fish Diseases》。

#### 主要关键技术方法

研究人员在2024年10月至11月期间，于新西兰北岛的Wakamoekau Creek和Lake ?noke（退化沿海湖泊）进行两次采样。社区团体和怀拉拉帕地区议会（Greater Wellington Regional Council）使用刺网和诱捕器捕获鱼类。共捕获302尾常见牛鱼，其中3尾出现鳍部结节，一尾样本保存于100%异丙醇并送至Cawthron Institute进行后续分析。研究人员对结节进行湿涂片和Diff-Quik染色观察，并对结节及附带皮肤进行福尔马林固定、石蜡包埋、切片及苏木精-伊红（H&E）染色用于组织病理学检查。利用DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen）提取结节基因组DNA，采用Kitamura等（2006）设计的LCDV通用引物（LCDVs-F和LCDVs-R）以及针对基因型I、II、III的特异性引物进行PCR扩增MCP基因。阳性PCR产物经磁珠纯化后，使用牛津纳米孔技术（MinION MK1C）进行测序。此外，新西兰动物健康实验室（Ministry for Primary Industries）独立进行DNA提取，并通过实时PCR排除外来疫病（如Megalocytivirus pagrus1）的感染。系统发育分析采用Clustal Omega比对，iqtree构建最大似然树，以欧洲鲽鱼LCDV1（L63545.1）为外群，通过1000次超快自举、SH-aLRT检验和近似贝叶斯检验评估节点支持度。

#### 研究结果

**3.1 大体检查与排除外来疫病**
大体检查显示Gobiomorphus cotidianus鳍部有白色结节（图2A-C），符合淋巴囊肿病的典型外观。实时PCR未检出Megalocytivirus pagrus1（传染性脾肾坏死病毒和真鲷虹彩病毒）。结节主要局限于背鳍和胸鳍（n=6），硬结节剖开后可见多个球形囊肿包埋于透明囊膜内（图2C-D）。Diff-Quik染色涂片显示胞浆内包涵体，无细菌或寄生虫证据（图2F）。

**3.2 组织病理学**
病变鳍组织的组织病理学检查发现多个肥大的成纤维细胞（图3A）。受感染细胞被厚的透明囊膜包裹，胞浆内包涵体（含嗜碱性物质）靠近囊膜膜（图3B-C）。细胞核不规则（图3D-E），胞质染色不均（图3C-F）。

**3.3 主要衣壳蛋白（MCP）基因的PCR检测**
以结节提取的gDNA为模板，使用通用引物扩增出609 bp的MCP基因片段（图4）。针对基因型I、II、III的引物均未扩增出产物。因此，将该新西兰LCDV分离株命名为LCDV-GcNZ。

**3.4 系统发育分析**
系统发育树（图5）显示LCDV-GcNZ与基因型IV（亦称LCDV-RC，来自中国和台湾；SB98Yosu，来自韩国）形成姐妹支。LCDV-GcNZ的分支长度明显长于基因型IV内部个体，表明其与该基因型存在显著分化。在国际病毒分类委员会（ICTV）认定的四个物种中，LCDV-GcNZ与LCDV3_LCDV-Sa和LCDV-4亲缘最近，但不属于其中任何一支，也不与包含两者的支系形成姐妹群。这表明该属需要正式描述更多新物种。

#### 讨论与结论

讨论部分指出，组织病理学结果与既往LCDV报告一致。Hine等（2016）曾根据超微结构形态发生学推测新西兰毒株可能是新型的，本研究分子证据支持了这一推测——MCP基因不属于基因型I、II或III，提示为未分类物种或新型变体。此前新西兰仅有零星LCD报道，且从未在淡水或河口野生鱼类中发现。两项调查中，只有Gobiomorphus属鱼类出现结节病，尽管该病已知感染超过150种鱼类。该病对新西兰本土鱼类或野生鱼类健康的潜在影响尚不明确，但许多淡水鱼类已因人为因素受到威胁，疫病可能进一步危及其生存。LCDV在圈养环境中研究较多，严重感染可导致经济损失，死亡率通常与严重功能障碍及继发感染相关。近期研究显示，中国某养殖场因环境变化日感染率达4000-10000尾鱼。LCDV最适生长温度约20°C，夏季高发，低温（10°C）下感染可长期持续而无临床病症。虹彩病毒科被认为是新西兰水生生物的已知威胁，进口卫生标准已对此设立管理条件。观赏鱼贸易是可能的引入途径，但LCDV-GcNZ与基因型IV的显著分化提示有限跨大陆基因流动、引入后长期演化或新西兰本土性。未来全基因组测序将有助于厘清关系。在G. cotidianus中检测到LCDV为病毒在淡水、河口和海洋环境传播提供了机会，因为该物种具有兼性双向洄游习性，可能促进不同水域间的连接。此外，仅凭大体检查诊断LCD可能与其他疾病混淆，例如牛鱼鳍下“白色增生物”曾被归因于吸虫囊蚴。研究人员鼓励通过初级产业部热线持续报告疑似病例，以增进对LCD在新西兰起源、近期出现、季节性和分布的理解。
**研究结论（翻译）**：本研究报道了新西兰与一种新型淋巴囊肿病毒变体相关的淋巴囊肿病，发生在新的地理区域和新的宿主鱼科中。组织病理学结果与疾病的其他报告一致。值得注意的是，Hine等（2016）根据观察到的超微结构形态发生学曾推测新西兰毒株可能是新型的。分子发现支持了这一假设：新西兰LCDV的MCP基因不具代表性基因型I、II或III，表明存在未分类物种或新型变体。此前，新西兰仅有少量淋巴囊肿报道，且直到现在，新西兰淡水或河口环境中的野生鱼类中仍未发现该病。在两次调查中捕获并释放的13种鱼中，除Gobiomorphus属外，没有其他鱼类出现结节病——鉴于LCD已在超过150种养殖和野生鱼类中报道，这是一项显著的观察。此前新西兰的淋巴囊肿检测（进口观赏鱼或野生海水鱼类）未提供分子数据，导致无法进行比较分析。