在重组中国仓鼠卵巢细胞系单细胞克隆过程中筛选双特异性抗体以提高滴度和产品质量

《Biotechnology Progress》：Screening of bispecific antibodies during single cell cloning of recombinant Chinese hamster ovary cell lines to improve titer and product quality

　　

治疗性双特异性抗体（bispecific antibodies, BsAbs）的开发带来了与正确链配对和杂质多样性增加相关的显著制造挑战。在此，研究人员通过细胞系开发（cell line development, CLD）过程中的产品品质评估来解决这一问题，无需在细胞系筛选过程中进行遗传表征。利用表达一组单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）和BsAbs的中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO）细胞系，研究人员在Bruker Beacon? Optofluidic系统上的单细胞克隆工作流程中证明了SpotLight? Huλ、Hu?和HuFc试剂对其靶标链同种型（lambda或kappa轻链和Fc区）的高度特异性结合。随后，研究人员展示了将SpotLight? Huλ和Hu?试剂组合使用，作为表达具有kappa-lambda双轻链构型BsAb的CHO细胞系的早期产品品质指标。在补料分批生物反应器生产评估后，每个SpotLight检测呈现相同结合图谱的细胞系表现出平台典型的异二聚体水平，平均为87.26%。相反，偏向于任一SpotLight?检测的细胞系导致异二聚体低于预期（0%–84.23%），并伴随相关杂质增加。本研究证明了双SpotLight?检测作为识别表达高异二聚体百分比kappa-lambda轻链BsAb的CHO细胞系的应用。这使得在CLD早期即可识别具有最佳产品品质的细胞系，从而减少进入资源密集型补料分批研究和后续产品品质评估的细胞系数量。此外，该检测提供了在开发下游纯化工艺之前表征杂质表达偏向的机会。

双特异性抗体（bispecific antibodies, BsAbs）的制造面临链配对错误和杂质多样性增加的挑战，尤其在细胞系开发（cell line development, CLD）中，传统筛选仅依赖滴度而无法早期评估产品品质。本研究的目的是在单细胞克隆阶段，利用双SpotLight检测预测BsAb异二聚体比例，以便提前筛选高质量细胞系，减少资源消耗。研究人员使用一组单克隆抗体（mAb）和BsAb分子（分子A-K），在Bruker Beacon? Optofluidic系统上进行单细胞克隆，并结合SpotLight? Huλ、Hu?和HuFc试剂的扩散检测。主要关键技术包括：Beacon? Optofluidic系统的单细胞克隆及SpotLight扩散检测（通过Opto-Electrical Positioning (OEP)技术分离单细胞并量化分泌抗体）；数字滴液聚合酶链反应（digital droplet PCR, ddPCR）分析基因拷贝数（使用来自GSK专有CHO-K1衍生的谷氨酰胺合成酶敲除细胞系）；Ambr? 15细胞培养生物反应器系统进行15天补料分批生产评估；以及反相液相色谱质谱（reverse-phase liquid chromatography mass spectrometry, RPLC-MS）分析产品纯度。样本来源于GSK专有细胞库，包括10种mAb/BsAb分子和双轻链构型BsAb分子K。

**3.1 SpotLight? reagents show binding specificity in qualitative and quantitative assays**
研究人员首先通过预测性结合免疫分析和Beacon? Optofluidic系统对10种mAb/BsAb分子进行验证，确认SpotLight? Huλ、Hu?和HuFc试剂对其靶标（lambda轻链、kappa轻链和Fc区）具有高度特异性结合。结果显示，含有Fc突变1的分子（如分子A、D、F、G、H、I、J）无法有效结合SpotLight? HuFc试剂；而含有kappa或lambda轻链的分子仅结合相应试剂。分子J（含kappa和lambda双轻链）在两种轻链检测中均呈阳性，但AuScore值低于单一轻链的mAb。

**3.2 Dual SpotLight? assays identify transfection pool heterogeneity on the Beacon? optofluidic system**
针对BsAb分子K（含kappa-lambda双轻链和Fc突变1），研究人员在Beacon系统上同时进行SpotLight? Hu?和Huλ检测。结果显示细胞系群体呈现广泛结合图谱，包括仅结合Huλ、仅结合Hu?以及两者均结合但比例不均的群体。基于AuScore比值，将96个细胞系划分为高kappa偏倚、部分kappa偏倚、无偏倚、部分lambda偏倚和高lambda偏倚五组，并导出进行后续分析。

**3.3 Dual SpotLight? Hu? and SpotLight? Huλ assay is predictive of imbalance in target plasmid copy number ratio**
通过ddPCR分析46个导出细胞系的基因拷贝数，发现轻链和重链的拷贝数与双SpotLight结合结果一致：arm B（lambda）的平均拷贝数（3.36 copies/μL）高于arm A（kappa）（2.47 copies/μL），且两个质粒内重链与轻链拷贝数高度相关（R²分别为0.922和0.983）。偏倚细胞系的基因拷贝数偏斜，进一步验证了双检测预测的准确性。

**3.4 Cell lines with highest SpotLight? Huλ AuScores (×1000) result in highest fed-batch production titers**
15天Ambr? 15补料分批生产后，总收获滴度范围为0.61–7.46 g/L，lambda偏倚组滴度最高（平均5.67 g/L），而kappa偏倚组最低（平均1.11 g/L）。“无偏倚”组平均滴度为4.42 g/L。总AuScore（Hu?+Huλ）与滴度呈正相关（R²=0.696）。细胞生长和代谢物谱在各组间无明显差异。

**3.5 Dual SpotLight? assays are predictive of BsAb heterodimer (%) purity**
RPLC-MS分析显示，“无偏倚”组和“部分kappa偏倚”组具有最高的异二聚体百分比（平均87.26%和84.23%），而偏倚组异二聚体显著降低（高kappa偏倚0.16%，高lambda偏倚0%）。杂质类型与偏倚方向一致：kappa偏倚组主要含半抗体A和同二聚体A，lambda偏倚组主要含半抗体B和同二聚体B。若仅用单一SpotLight? Hu?或Huλ检测选择前25%高分细胞系，平均异二聚体仅为38.9%和15.9%。与亲代转染池相比，“无偏倚”细胞系的异二聚体百分比略高（个别细胞系提高17.10%），滴度显著提高（平均提高1.16 g/L，p=0.020）。

**总结讨论部分**：研究表明，双SpotLight? Hu?和Huλ检测可在CLD早期预测BsAb的产品品质，避免推进低异二聚体的细胞系进入资源密集型生产研究。该方法特异性识别表达kappa-lambda双轻链BsAb的细胞系，并揭示了基因拷贝数平衡与异二聚体水平的相关性。其局限性包括仅适用于该构型及依赖Beacon系统，但未来可组合其他检测（如聚集和糖基化）扩展应用。**研究结论**：双SpotLight? Hu?和Huλ检测的组合使用能够区分产生更高比例正确配对异二聚体的细胞系，与遗传表征结果一致，且可在单细胞克隆时实时部署。仅使用单一轻链检测会优先选择杂质偏高的细胞系。本研究提供了在CLD早期筛选适合商业开发细胞系的能力。