《Smart Molecules》：Innovative 3D-bioprinted microfibers in calcium phosphate cement platform with Nell-1 to activate nerve-bone axis for synergistic bone, vasculature, and nanofibrous nerve regeneration
编辑推荐：
临界尺寸骨缺损仍是持续的临床挑战，主要因为传统支架无法重现支撑功能性骨再生的纳米纤维神经血管架构。研究人员提出一种突破性3D生物打印平台，将负载人牙周膜干细胞(hPDLSCs)的藻酸盐微纤维(aMF)与钙磷酸盐水泥(CPC)基质结合，创建桥接机械稳定性与纳米纤
临界尺寸骨缺损仍是持续的临床挑战，主要因为传统支架无法重现支撑功能性骨再生的纳米纤维神经血管架构。研究人员提出一种突破性3D生物打印平台，将负载人牙周膜干细胞(hPDLSCs)的藻酸盐微纤维(aMF)与钙磷酸盐水泥(CPC)基质结合，创建桥接机械稳定性与纳米纤维神经血管引导的混合环境。该平台工程化用于Nell-1的时空递送，独特激活新型“神经-骨”轴。Nell-1结合启动CYFIP1介导的CGRP-β3微管蛋白级联，放大神经血管与骨交互。双相释放曲线作为关键设计特征出现：早期信号为神经血管浸润创造有利微环境，随后随时间持续信号。两阶段协同使成骨增加2倍、血管生成增加3倍、神经支配增加2倍。在大鼠颅缺损中测试时，该构建体使骨与神经再生翻倍、血管密度增至3倍，治愈率超越现有方法。机制上，研究人员将Nell-1重新定义为双重成骨-神经生成调节因子，利用内源性干细胞驱动结构与功能修复。这种CPC内3D生物打印微纤维系统超越被动支架，动态耦合结构支撑与生物活性信号，为神经血管化骨重建提供变革策略。
研究背景与立项依据
临界尺寸骨缺损由创伤、肿瘤切除或退行性病变引起，传统骨组织工程策略仅部分成功。现有方法偏重矿化组织形成，未能复现支撑功能性骨再生的神经血管网络，而完整骨再生本质是骨、血管、神经三组织同步发育过程，依赖“神经-骨”轴动态交互。骨骼并非惰性结构框架，感觉、交感与副交感神经通过降钙素基因相关肽(CGRP)、β3-微管蛋白(β3-Tubulin)及CYFIP1等反馈调控骨代谢。既往支架难以同时支撑成骨、血管生成与神经支配，瓶颈在于物理架构与生物信号时空序列无法匹配三组织再生程序。为此，研究人员战略选用具多效性的Nell-1，结合钙磷酸盐水泥(CPC)即时机械支撑与3D生物打印藻酸盐微纤维(aMF)封装人牙周膜干细胞(hPDLSCs)的缓释体系，构建双相释放混合支架，主动编排神经-骨轴。该文发表于《Smart Molecules》。
主要关键技术方法
研究采用3D生物打印FRESH支撑浴策略制备藻酸盐微纤维(aMF)，封装hPDLSCs与Nell-1；CPC基质提供早期释放与力学支撑；建立双相Nell-1释放动力学。体外以第3–5代人牙周膜干细胞(hPDLSCs)为细胞模型，施以0、50、100 ng/mL Nell-1处理，结合RNA测序、Western blot、ALP/ARS染色、管腔形成实验。体内采用雄性Sprague-Dawley大鼠（180–220 g）双侧颅骨5 mm直径临界缺损模型，分组植入空白对照(CPC)、阴性对照(CPC-aMF无Nell-1/hPDLSCs)、单载Nell-1、单载hPDLSCs及双载hPDLSCs+Nell-1双相释放组，于1、4、8、12周取标本行Micro-CT、HE、Masson、虚拟组织学及CD31/CGRP/β3-Tubulin免疫染色评估。
研究结果
2.1 Nell-1对hPDLSCs体外成骨作用及机制
100 ng/mL Nell-1处理7/14天，碱性磷酸酶(ALP)表达与活性约增4倍，21天矿化结节显著增加；Western blot显示CYFIP1与Runx2在过表达组上调，Forskolin(激动)与雷帕霉素(抑制mTOR)干预证实CYFIP1介导级联参与Nell-1促成骨，Nell-1经神经源CYFIP1上调Runx2并增强CGRP分泌，激活神经-骨轴。
2.2 Nell-1处理hPDLSCs的RNA测序谱
7348个差异基因(log2FC>1.0, p<0.05)，KEGG/GO富集指向成骨与神经相关通路；CYFIP1与PRRC2A及WASF1/WASF2/NCKAP1/ABL1、NFKBIL1/GPANK1/ABHD16A/VARS网络被识别为神经长入关键节点。
2.3 3D生物打印CPC-aMF支架设计与表征
FRESH打印参数27 G针、10 mm/s、1.5–1.8 kPa，微纤维径100–300 μm；CPC经FTIR/AFM确认；复合支架弯曲强度与弹性模量高于松质骨，aMF在CPC中形成孔隙与微通道。
2.4 支架表征
SEM显示aMF降解后hPDLSCs经孔伸展；CPC-MF 1月降解30%–40%（空白CPC仅10%–15%）；Nell-1双相释放：CPC相第1–2天达峰，aMF相第6–8天达峰，12天完毕；活死染色证实0–14天hPDLSCs存活增殖。
2.5 体内成骨效应（大鼠颅骨缺损）
双载组4/8/12周Micro-CT的BV/TV、HE/Masson/虚拟组化显示新骨体积较阴性对照翻倍。
2.6 体内血管化与神经支配
CD31染色示双载组血管密度较阴性对照增3倍（较空白CPC增6倍）；CGRP与β3-Tubulin第1周缺损缘出现、第4周增强，神经支配较阴性对照增2倍（较空白增20倍）。
讨论总结
研究证明双相Nell-1释放CPC-aMF-hPDLSCs系统同步驱动成骨、血管、神经三组织，机制为Nell-1→CYFIP1→Runx2及CGRP正反馈；早期(第1周)神经血管长入先于第12周强效成骨，复现发育序列。hPDLSCs源于神经血管丰富微环境，具成骨-神经分泌优势；CPC提供力学、aMF提供引导、双相Nell-1提供时空指令，三者耦合克服单组织导向支架局限。讨论指出CYFIP1-Runx2-CGRP全网络未完全绘制，颅 versus 牙槽骨位点差异、大动物长期神经血管宿主整合、制造放大与组合产品监管仍需后续工作。
结论部分翻译
本研究呈现一种具双相Nell-1释放与hPDLSCs封装的3D生物打印CPC-aMF支架，主动调制“神经-骨”轴，在大鼠颅缺损中实现成骨2倍、血管生成3倍、神经支配3倍提升；较空白对照新骨形成增4倍。机制研究揭示Nell-1经CYFIP1/PRRC2A信号介导神经-骨交互，首次阐明神经通路直接增强骨再生的机制。支架集成CPC力学稳定、aMF神经血管引导与Nell-1时空递送，克服功能骨修复现状瓶颈，标志骨组织工程从被动支撑向主动多组织微环境编排的范式转移，在颅面与承重骨重建具临床转化潜力。
