Pictor靶向蛋白质组学检测方法对可提取核抗原的诊断性能与商业线性免疫测定和可寻址激光微珠免疫测定平台的比较

《Journal of Immunological Methods》：Diagnostic performance of Pictor's targeted proteomics assay for extractable nuclear antigens compared with commercial line immunoassay and addressable laser bead immunoassay platforms

　　

可提取核抗原(ENA)抗体检测是诊断系统性自身免疫性风湿病(SARDs)的通用方法。然而，当前商业多重检测平台需要昂贵的仪器，在中低收入国家常规检测中常因成本过高而受限。Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA检测被开发为一种可负担、可扩展的替代方案，用于同时检测ENA抗体。研究人员将检测性能与Euroimmun ENA线性免疫测定和BioPlex 2200 ENA检测进行比较，使用自身免疫性疾病患者的临床血清样本。通过三项和成对分析评估检测间的一致性，表示为阳性一致性百分比(PPA)、阴性一致性百分比(NPA)和总体一致性。分析精度在批次内和批次间进行评估。Pictor多重检测与已建立的商业平台显示出高度一致性。所有检测的三项一致性范围从TRIM21/Ro52的67.3%到Jo-1的100%，Sm、CENP-B的一致性为95%。成对比较显示大多数自身抗体的PPA和NPA值超过85%。Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA检测提供了与Euroimmun和BioPlex平台相当的诊断性能，同时保持了传统ELISA格式的易实施性和可扩展性。这些结果支持其作为ENA抗体检测的具有成本效益和可及性工具的潜力，适用于不同资源水平的实验室。

**论文解读文章**

**研究背景与目的**
自身免疫性疾病在全球范围内发病率持续上升，对医疗系统造成日益沉重的负担。系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征、系统性硬化症等疾病影响数百万人，且发病年龄趋于年轻化。然而，准确且可负担的诊断检测在许多地区仍十分有限。商业自身免疫血清学平台通常针对高收入医疗环境优化，需要昂贵仪器、专用试剂和集中化实验室基础设施，导致中低收入国家诊断能力受限，可提取核抗原(ENA)抗体（系统性自身免疫性风湿病(SARDs)的重要标志物）检测常不可及或延迟。SARDs的诊断评估通常采用序贯检测：先通过抗核抗体(ANA)筛查，再进行ENA抗体检测以识别特定自身抗体，如抗TRIM21/Ro52、抗TROVE2/Ro60、抗SSB/La、抗Sm、抗RNP/Sm、抗Scl-70、抗Jo-1和抗CENP-B。目前尚无公认的ENA检测金标准，不同国家实验室使用不同平台，包括线性免疫测定、微珠多重免疫测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)，各自具有独特的抗原制备和检测系统，导致实验室间结果差异大。现有商品化多重检测的高运营成本和基础设施要求限制了其在资源有限环境中的推广。为此，Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA靶向蛋白质组学检测被开发为一种可扩展且可能更经济的替代方案，用于同时检测多种ENA特异性抗体。该平台采用微阵列式印刷基质，置于传统96孔ELISA板中，纯化自身抗原共固定于单个孔内，基于辣根过氧化物酶(HRP)-四甲基联苯胺(TMB)显色反应，信号通过PictImager?捕获并量化，使其适用于不同技术基础设施的实验室。本研究旨在比较Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA检测与两种已建立商业平台（Euroimmun ENA线性免疫测定和BioPlex ENA多重免疫测定）的性能，评估三项一致性和成对一致性，以及分析精度。论文发表在《Journal of Immunological Methods》。

**关键技术方法概述**
研究人员从商业来源（iNo Specimens Biobank, France）获得两组自身免疫性疾病患者血清样本，并补充健康供体血清（来自Pictor子公司Pictor Diagnostics India Pvt. Ltd.）。第一组样本（60例自身免疫疾病患者血清、6例抗Jo-1抗体阳性血清添加的健康人血清、7例ANA阴性健康对照）用于建立阈值，第二组（89例自身免疫疾病患者血清）用于性能评估。所有样本在本地临床免疫实验室（Pathlab, Tauranga, New Zealand）使用EUROLineScan ENA线性免疫测定进行检测。Pictor平台的抗原包括RNP/Sm、TROVE2/Ro60、TRIM21/Ro52、SSB、Jo-1、Scl-70、Sm、CENP-B，均来自Arotec, New Zealand。检测流程为间接ELISA，血清稀释后加样，经HRP标记山羊抗人IgG孵育和TMB显色，信号由PictImager?读取。分析精度通过批次内和批次间变异系数(CV%)评估，一致性通过阳性一致性百分比(PPA)、阴性一致性百分比(NPA)和总体一致性计算，并采用Cohen's kappa系数和McNemar检验。

**研究结果**

**3.1 Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA检测在阳性与阴性对照血清之间显示出清晰且可重复的信号区分**
通过将八种常用ENA抗原（RNP/Sm、TROVE2/Ro60、TRIM21/Ro52、SSB、Jo-1、Scl-70、Sm、CENP-B）整合到检测中，Pictor平台在阳性对照（多克隆抗ENA抗体）与阴性对照（无ENA反应性的人IgG）之间产生了明确且可重复的信号差异，阳性对照呈现清晰的抗原特异性信号，阴性对照背景信号极低。三次独立实验的汇总数据表明，该平台能一致区分所有ENA抗原的阳性与阴性对照，支持其用于ENA抗体检测的潜力。

**3.2 Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA检测阈值的建立**
使用接收者操作特征(ROC)曲线分析确定各抗原特异性阈值。分析基于第一组样本（60例自身免疫患者、6例Jo-1添加血清、7例健康对照），以Euroimmun线性免疫测定结果为参考。所有ENA抗原的曲线下面积(AUC)均大于0.80，其中TROVE2/Ro60、TRIM21/Ro52和SSB的AUC最高，表明与参考方法高度一致。通过Youden指数确定最佳阈值，各抗原的PPA和NPA大多超过90%，进一步验证了阈值区分阳性与阴性样本的有效性。

**3.3 Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA检测与两种商业多重平台显示出高度一致性**
使用第二组样本（89例自身免疫疾病患者血清）进行三项一致性分析，与Euroimmun和BioPlex平台比较。总体三项一致性从TRIM21/Ro52的67.3%到Jo-1的100%，Sm和CENP-B均为95%，RNP/Sm为84.2%，Scl-70为83.2%，TROVE2/Ro60为80.2%，SSB为72.3%。成对（两两）分析显示，Pictor与Euroimmun及BioPlex之间的PPA和NPA值大多超过85%。Jo-1在所有成对比较中均为100%一致。CENP-B的Pictor与两平台间PPA为100%，NPA>94%。Sm的NPA≥97%，但BioPlex与Euroimmun间PPA较低（57.1%）。TRIM21/Ro52的BioPlex与Euroimmun间PPA仅为61.8%，NPA为86.6%，符合已知的平台间变异。这些结果表明，Pictor平台在Sm、CENP-B和Jo-1检测方面与商业平台高度一致，而TRIM21/Ro52和SSB的差异反映了抗原特异性变异。

**3.4 Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA检测显示出高分析精度**
分析精度评估了批次内和批次间重复性。批次内：同一批次的三个板检测高、中、低反应性血清，变异系数(CV%)范围为1.2%至18.9%，高反应性样本CV%多低于15%，低反应性样本CV%较高（15-19%）。TRIM21/Ro52、SSB和Sm的中高反应性样本CV%在1%-10%之间。批次间：三个独立生产批次测试相同血清，CV%范围为1.8%至33.3%，高反应性样本CV%低于15%，中反应性样本CV%在15-25%，低反应性样本（如Sm和CENP-B）CV%大于20%。这些结果支持Pictor平台在批次内和批次间具有稳定的分析精度，可用于一致的ENA抗体检测。

**讨论与结论**
本研究显示，Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA检测与Euroimmun和BioPlex平台具有可比性，三项一致性范围67.3%-100%，其中Jo-1、Sm和CENP-B一致性最高。TRIM21/Ro52和SSB的较低一致性符合已知的检测间变异，可能源于抗原制备差异。研究局限性包括：部分抗体（如Jo-1）阳性样本数量有限，使用添加样本可能不完全反映临床样本；与现有检测比较而非临床参考标准，无法评估真实诊断准确性；抗原面板仅限于常用ENA靶标，未包括抗双链DNA等标志物；未正式评估成本、工作流程或在不同实验室的实施情况。总体而言，Pictor PictHealth? Immunoscreen ENA检测性能与已建立平台相当，其96孔板格式和基于ELISA的工作流程有助于在已开展ELISA检测的实验室中推广使用，为不同资源水平的实验室提供了一种经济且可及的ENA抗体检测工具。