《GLIA》：Navigating Human Astrocyte Differentiation: Direct and Rapid One-Step Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells to Functional Astrocytes Supporting Neuronal Network Development
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星形胶质细胞在神经元网络发育中扮演关键角色。尽管星形胶质细胞在神经系统疾病的病理生理学中的作用已广为人知，但诱导多能干细胞（iPSC）来源的星形胶质细胞在神经元网络中的应用仍然有限。研究人员在此提出一种简化的单步法方案，可将iPSC直接分化为功能性星形胶质细胞
星形胶质细胞在神经元网络发育中扮演关键角色。尽管星形胶质细胞在神经系统疾病的病理生理学中的作用已广为人知，但诱导多能干细胞（iPSC）来源的星形胶质细胞在神经元网络中的应用仍然有限。研究人员在此提出一种简化的单步法方案，可将iPSC直接分化为功能性星形胶质细胞，无需异位基因表达或神经祖细胞生成。研究人员发现，将iPSC直接培养于商业星形胶质细胞培养基中，足以在5周内将其分化为功能性星形胶质细胞。来自10个独立实验室的研究人员成功分化了超过60个iPSC系。iPSC-星形胶质细胞培养的验证显示，星形胶质细胞分化一致，批次间变异极小。对部分iPSC系的深入表征通过免疫荧光、流式细胞术、RNA测序、谷氨酸摄取实验和钙信号记录，确认了iPSC-星形胶质细胞单一培养物的星形胶质细胞身份和功能。方案的优化使得iPSC-星形胶质细胞能够与Ngn2 iPSC来源的神经元（iNeurons）共培养，促进神经元分化和突触形成。最后，研究人员通过4名独立研究人员使用单细胞电生理学和多电极阵列，确认了5周龄的iPSC-星形胶质细胞与iNeuron共培养物中稳健的神经元网络发育。该方案提供了一种快速高效的方法来建立全人星形胶质细胞-神经元共培养体系，有助于研究细胞类型特异性对疾病发病机制的贡献。其在10个独立实验室中于众多iPSC系上的验证，凸显了该方案的可重复性，并使其成为推动人类神经网络疾病建模的平台。
**论文解读文章**
**研究背景、存在问题与开展本研究的必要性**
星形胶质细胞是大脑中最丰富的胶质细胞类型，最初被认为仅提供物理和结构支持。然而，近年来越来越多的研究认识到星形胶质细胞在神经元发育和功能中的关键作用，包括神经发生、突触形成与成熟、代谢支持、突触可塑性、神经递质摄取、血脑屏障维持及血流调节等。星形胶质细胞的功能异常已与多种神经发育和神经退行性疾病密切相关。诱导多能干细胞（iPSC）技术为在体外研究人类大脑发育提供了途径，尤其是利用患者来源的细胞模拟疾病。常用的谷氨酸能神经元分化方案（如Ngn2过表达诱导神经元，iNeurons）通常需要与功能性星形胶质细胞共培养以支持其存活和成熟，但以往多使用原代啮齿动物星形胶质细胞。啮齿动物星形胶质细胞存在基因组和功能差异，且其野生型背景可能掩盖疾病相关神经元的表型，尤其对于代谢性疾病。因此，理想情况下iNeurons应与同基因型的iPSC来源星形胶质细胞共培养，以研究细胞类型特异性疾病效应。目前已报道多种iPSC-星形胶质细胞分化方案，主要分为两类：通过转录因子（如SOX9、NFIA、NFIB）异位基因表达直接分化，或通过神经祖细胞（NPC）中间步骤分化。前者往往培养物均一性高，但缺乏体内星形胶质细胞的多样性；后者可产生更异质的星形胶质细胞群体，但耗时长且纯度不一。此外，这些方案的功能验证多局限于星形胶质细胞单一培养物，缺乏其在共培养中支持神经元能力的系统性评估。因此，研究人员旨在开发一种高效、稳健、可重复的iPSC-星形胶质细胞分化方案，使其既能用于星形胶质细胞疾病建模，又能与iNeurons共培养并支持其功能。
**研究人员开展的研究、结论与意义**
研究人员受“we are what we eat”原则启发，开发了一种快速、简单的单步方案：将iPSC直接培养于商业星形胶质细胞培养基（AM，ScienCell）中，5周内直接分化为功能性星形胶质细胞。该方案无需异位基因过表达（约1个月的构建体稳定表达）或中间NPC分化步骤（约1个月NPC分化）。研究人员在10个独立实验室中成功分化了64个iPSC系，包括商业对照系、患者来源系和同基因系。通过免疫荧光、流式细胞术、RT-qPCR、RNA测序、谷氨酸摄取实验、钙信号记录、生物胞素填充—膜片钳、Olink蛋白质组学等多种方法，对部分iPSC-星形胶质细胞系在单一培养和与iNeurons共培养中的身份、功能和成熟度进行了深入表征。结果显示，该方案产生的星形胶质细胞在形态、标志物表达和功能上具有一致性，批次间变异小。将iPSC-星形胶质细胞与Ngn2-iNeurons共培养，经优化后的方案（如星形胶质细胞在神经元分化第6天加入，神经元:星形胶质细胞比例2:1，使用AM胎牛血清等）支持稳健的神经元网络发育，表现为突触形成、自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）和多电极阵列（MEA）上出现网络爆发（NBs），且该网络活动在4名独立研究人员间具有一致性。该方案的多系和跨实验室验证证明了其可重复性和广泛适用性，为建立全人类星形胶质细胞-神经元共培养系统、研究细胞类型特异性疾病机制提供了一个高效平台。论文发表在《GLIA》。
**主要技术方法（不超过250字）**
1. **iPSC-星形胶质细胞直接分化**：iPSC单细胞接种于人重组laminin-521（Biolaminin）包被的平板，在商业星形胶质细胞培养基（AM，ScienCell）中培养5周，定期传代。部分系需调整初始接种密度、使用RevitaCell或去除FBS以优化分化。
2. **iNeurons分化与共培养**：携带Ngn2-rtTA稳定载体的iPSC经多西环素诱导分化为兴奋性神经元，在分化第6天加入iPSC-星形胶质细胞（比例2:1），于神经基础培养基中维持。
3. **功能验证**：采用免疫荧光、流式细胞术（检测CD44、CD49f）、RT-qPCR、RNA测序、谷氨酸摄取实验（Amplex Red试剂盒）、钙成像（Fluo-8-AM）、单细胞膜片钳（记录被动膜特性及sEPSCs）、生物胞素填充示踪间隙连接、Olink蛋白质组学（Target 96炎症面板）分析分泌组、多电极阵列（MEA，Axion Maestro Pro）记录自发网络活动。
**研究结果**
**3.1 从iPSC直接分化为形态成熟的星形胶质细胞**
通过将iPSC单细胞接种于Biolaminin包被板并在AM中培养，研究人员观察到48小时内细胞形态从紧凑变为扁平，5周后形成异质性培养物（细胞大小和形态差异）。64个iPSC系在10个实验室中成功分化，各系批次间形态一致，最小化批次间变异。使用仙台病毒重编程的系表现出延迟分化。
**3.2 功能性星形胶质细胞标志物的表达确认iPSC来源星形胶质细胞的成熟**
流式细胞术显示，92%的细胞存活，70%共表达CD49f和CD44，表明星形胶质细胞谱系和异质性。RT-qPCR显示NFIA、VIM、CD44、GFAP、AQP4随时间动态变化（如CD44在DIV34达峰，AQP4 RNA下降但蛋白在后期局限于终足）。免疫荧光证实EAAT1、GLUD1、PDLIM7等标志物随时间上调，GFAP和CD44在DIV45高于DIV111。
**3.3 RNA测序确认iPSC-星形胶质细胞的星形胶质细胞身份**
批量RNA测序比较了5个iPSC-星形胶质细胞系和3个NPC来源星形胶质细胞系与死后人星形胶质细胞及其他中枢神经系统细胞类型的数据。主成分分析和层次聚类显示，所有星形胶质细胞（无论来源）紧密聚集，与神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞分离。iPSC-星形胶质细胞高表达星形胶质细胞基因（VIM、GJA1、CD44、PDLIM7、TNC、APOE、GLUD1、GLUL、NFIX），低表达神经元基因（DCX、NGN2、RBFOX3）和少突胶质细胞基因（SOX10、MBP），且不表达iPSC基因（OCT4、SSEA4）。但GFAP、S100B、谷氨酸转运体基因SLC4A4、SLC1A2表达相对较低，提示DIV35的iPSC-星形胶质细胞类似发育中或未成熟星形胶质细胞。
**3.4 功能表征确认iPSC-星形胶质细胞摄取谷氨酸和形成间隙连接的能力**
谷氨酸摄取实验显示，10个iPSC-星形胶质细胞系中3个摄取20%–30%的谷氨酸（为啮齿动物星形胶质细胞的2–3倍），4个摄取5%–10%，3个摄取极少。生物胞素填充—膜片钳显示，单个注射的iPSC-星形胶质细胞能将示踪剂扩散至相邻细胞，表明形成间隙连接介导的星形胶质细胞合胞体。钙成像显示，基线时星形胶质细胞有自发钙波，50 μM谷氨酸刺激后钙信号显著增加。
**3.5 iPSC-星形胶质细胞分泌参与神经元和胶质细胞发育的生长因子**
Olink蛋白质组学分析DIV35 iPSC-星形胶质细胞上清液，发现高分泌MCP-1、IL-6、HGF、TWEAK、VEGFA（影响神经元功能发育）、CSF-1（影响小胶质细胞和少突胶质细胞发育）及LIF（参与星形胶质细胞发育）。
**3.6 优化iPSC-星形胶质细胞与iNeurons共培养方案**
通过多次调整（如星形胶质细胞加入时间从DIV3改为DIV6，比例从1:1改为2:1，使用AM FCS代替标准FCS，加入RevitaCell，降低多西环素浓度等），最终方案使所有生物学重复在MEA上显示一致的网络爆发（NBs）频率和持续时间。
**3.7 iPSC-星形胶质细胞在共培养中支持神经元发育、成熟和突触形成**
免疫荧光显示，多种iPSC系的共培养均产生良好神经元形态（纤细树突，无聚集），星形胶质细胞终足与树突相互作用。两批次共培养中突触素（Synapsin）点计数无显著差异（约3个点/10 μm），与啮齿动物星形胶质细胞共培养相当。
**3.8 iPSC-星形胶质细胞在MEA上支持iNeurons的稳健同步化活动**
四孔生物学重复在DIV21–51间表现一致的NB频率和持续时间，网络活动始于DIV30（晚于啮齿动物星形胶质细胞共培养的DIV14–23）。DIV35的全细胞电压钳记录显示神经元接收突触输入并出现爆发活动。四名来自两个实验室的研究人员使用不同iPSC系重复实验，网络爆发出现时间略有差异（DIV35–58），但每批内一致性良好。
**3.9 从iPSC-星形胶质细胞-iNeuron共培养中去除FBS降低变异**
去除FBS后，iPSC-星形胶质细胞仍表达星形胶质细胞标志物（VIM、NFIA），且谷氨酸转运体SLC1A3表达升高，提示更稳态表型。meta分析（20块MEA板，3298次记录）显示，FBS去除后主成分空间中的点分布更紧凑，且仅3/73个电生理参数（均为记录内变异性指标）显著变化，核心网络参数（如平均发放率）不变，表明FBS去除降低跨孔和记录内变异而不损害网络功能。
**3.10 方案的最终调整**
简化传代步骤（减少胰酶体积、直接稀释后接种）；将首次传代改为从6孔板1孔传至新6孔板3孔（1:3），以减少附着问题。
**总结讨论与结论翻译**
**讨论部分总结**：研究人员开发的方案通过仅使用商业AM直接分化iPSC为功能性星形胶质细胞，已成功在10个独立实验室的64个iPSC系中得到验证。星形胶质细胞单一培养物中的形态异质性可能源于基因背景而非环境因素，但未发现异质性程度与共培养质量的直接关联。RNA测序显示iPSC-星形胶质细胞和NPC来源星形胶质细胞高度相似，跳过NPC中间步骤影响极小。在共培养中，多次优化（如细胞比例、FBS类型、加入时间）最终实现了可重复的神经元网络活动。网络活动开始时间晚于啮齿动物星形胶质细胞共培养，符合人类发育延迟的特点。FBS去除降低了变异并可能促进更稳态的星形胶质细胞表型。该方案与最新开发的小胶质细胞分化方案兼容，可实现三元共培养。长期网络动力学观察显示活动在DIV37后逐渐下降，可能与突触修剪、稳态可塑性及星形胶质细胞调节有关。潜在局限包括：商业AM成分未知难以分解机制，星形胶质细胞仍处于未成熟阶段，谷氨酸摄取效率在系间存在差异。
**研究结论翻译**：总之，研究人员的结果表明，使用商业AM直接分化iPSC为星形胶质细胞可一致地获得成熟和功能性的星形胶质细胞。这些iPSC-星形胶质细胞在与iNeurons共培养时能功能性支持神经元网络形成，展现一致的神经元网络模式。尽管承认不同iPSC系间存在变异性，但批次间变异极小。从共培养中去除FBS降低了神经元网络活动的跨孔和记录内变异。来自超过60个iPSC系的结果显示，iPSC-星形胶质细胞分化方案及共培养方案均稳健一致，可用于细胞类型特异性疾病建模和表型分析。
