共价配体结合的热力学表征

《British Journal of Pharmacology》：Thermodynamic characterisation of covalent ligand binding

　　

背景与目的：差示扫描荧光法（DSF）是一种常见且直接的方法，用于评估蛋白质的热稳定性，并已被广泛用于配体结合表征以及筛选。一类较少通过DSF评估的化合物是共价结合剂。在此，研究人员评估了共价键对蛋白质热稳定化的贡献。

实验方法：研究人员针对五个模型蛋白质靶标评估了选择性共价结合剂以及非选择性反应性亲电试剂。为了在基于片段的亲电筛选背景下评估DSF，研究人员将DSF测量与亲电片段子集上的共价标记进行了比较。

关键结果：研究人员表明，在选择性结合剂的背景下，共价键的形成增加了热稳定化。然而，稳定蛋白质的并非共价键本身，因为非选择性不可逆结合通常是中性的，或者更常见的是使蛋白质不稳定。在片段筛选的背景下，热位移的大小倾向于随着不可逆标记而增加，而更具反应性的片段倾向于使蛋白质不稳定。

结论与启示：综上所述，研究人员建议DSF作为一种补充方法，用于对共价片段命中进行筛选，其中显示标记和蛋白质稳定化的片段被预测为表现出分子识别驱动的结合，并作为共价配体开发的更有效起点。

**研究背景与问题**

蛋白质在天然态与变性构象之间存在动态平衡，配体结合可通过稳定特定构象驱动平衡移动。差示扫描荧光法（DSF）通过测定蛋白质熔解温度（T_m，即50%蛋白质折叠的温度）广泛用于评估配体结合及片段筛选。共价结合剂因其在效力、选择性和作用持续时间上优于非共价配体而备受关注，但共价配体发现面临挑战，包括反应性混杂和精确几何要求。共价片段筛选日趋普遍，但区分特异性结合（由分子识别驱动）与反应性驱动结合（依赖共价键而非结构互补）是核心难题。共价键形成对蛋白质热稳定性的具体贡献尚不明确——既可能通过延长配体驻留间接稳定，也可能因非特异性修饰导致去稳定化。现有研究虽有稳定化或去稳定化案例，但未系统解耦非共价识别与共价键形成的相对作用。为此，研究人员系统评估了共价键对蛋白质热稳定性的影响，并探索DSF在亲电片段筛选中的应用。该研究发表于《British Journal of Pharmacology》。

**研究方法概述**

研究人员采用DSF测定了共价及非共价化合物与五种模型蛋白（BTK、K-rasG12C、SARS-CoV-2 Mpro、Pin1、Keap1）结合后的T_m变化。通过LC/MS确认蛋白质标记程度，确保达到完全标记。针对Keap1，利用2612个丙烯酰胺片段（来自Enamine亲电片段库，8 μM片段，2 μM蛋白，4°C孵育24 h）进行大规模片段筛选，并用LC/MS检测标记率。对84个代表性片段进行DSF亚筛选，结合GSH反应性测定（评估片段亲电性）和剂量-反应标记实验，分析标记与热位移的关系。关键技术包括：DSF、完整蛋白质LC/MS、GSH反应性测定（t_1/2）、以及SARS-CoV-2 Mpro荧光活性测定。

**研究结果**

**3.1 BTK**
针对BTK（布鲁顿酪氨酸激酶）激酶结构域，共价不可逆抑制剂（ibrutinib、acalabrutinib、evobrutinib）均引起显著T_m升高（10.9–12.3°C）。其非共价胺前体（ibrutinib amine、evobrutinib amine）产生的稳定化幅度较小（ibrutinib amine降低2.7°C），或几乎无稳定化（evobrutinib amine）。非特异性不可逆亲电试剂（RA13、iodoacetamide、bromomethacrylate）虽实现100%标记，却导致T_m降低（-0.3°C至-2.4°C）。表明特异性非共价相互作用是稳定化的基础，共价键在非共价背景下可进一步增强稳定化，而非特异性修饰则去稳定化。

**3.2 K-rasG12C**
共价抑制剂sotorasib和adagrasib使K-rasG12C（G12C突变体）T_m升高5.0–5.4°C，而其非共价胺前体无稳定化效应。adagrasib衍生化合物（衍生1、衍生2）因结构差异（如芳香核心、丙烯酰胺取代）分别产生15.0°C和7.3°C的更大稳定化。非特异性共价试剂（RA13、iodoacetamide、bromomethacrylate）影响微弱或去稳定化。对K-rasG12D突变体（缺乏Cys-12）无任何化合物引起稳定化，证实共价修饰Cys-12是稳定化的直接原因。

**3.3 SARS-CoV-2 Mpro**
非共价抑制剂（化合物19）和可逆共价抑制剂（nirmatrelvir）均稳定化Mpro（T_m升高11.4–14.2°C），幅度相近。不可逆肽基共价抑制剂（CVD-016334、CVD-016335）尽管IC₅₀较高，却产生更大的T_m升高（21.0–21.6°C），表明不可逆共价键对稳定化的贡献可能超过结合亲和力。非特异性RA13引起适度稳定化（4.6°C），iodoacetamide无影响，bromomethacrylate则去稳定化。

**3.4 Pin1**
特异性共价抑制剂sulfopin稳定化Pin1（T_m升高3.1°C），而三种非特异性共价试剂（RA13、iodoacetamide、bromomethacrylate）均显著去稳定化Pin1（T_m降低14.0–14.8°C），表明Pin1对非特异性修饰高度敏感。

**3.5 Keap1**
可逆共价bardoxolone（BDX）衍生物（BDX-COOH、BDX-Me、BDX-ethyl amide）稳定化Keap1（T_m升高5.8–8.6°C），不可逆共价VVD-130037稳定化幅度较小（3.5°C）。非特异性RA13和iodoacetamide去稳定化或微弱，而bromomethacrylate意外稳定化Keap1（4.8°C），提示可能形成额外非共价相互作用。

**3.6 DSF可用于亲电片段筛选的命中选择**
Keap1丙烯酰胺片段筛选（2612个片段）中，52%无标记，<1%标记率>80%。对84个片段的DSF亚筛选显示，标记率越高，热位移绝对值越大（正或负）。GSH反应性测定表明，去稳定化片段多为高反应性化合物，而稳定化片段富集于低反应性化合物。提示DSF可区分由分子识别驱动的稳定化片段与由反应性驱动的去稳定化片段。

**讨论与结论**

研究人员通过系统比较发现，反应性本身不驱动蛋白质稳定化；非特异性不可逆结合通常中性或去稳定化，而特异性共价结合剂的稳定化必须依赖非共价相互作用背景。共价键的加入可在非共价基础上进一步稳定蛋白质，推测通过消除配体解离延长作用时间。对于Keap1，可逆共价BDX衍生物比不可逆VVD-130037稳定化更强，可能与晶体学揭示的结合沟加深及静电互补有关。片段筛选数据显示，标记与热位移正相关，但高反应性片段倾向于去稳定化，因此DSF可作为快速补充方法，优先筛选出同时显示标记和稳定化的片段，这些片段被认为具有分子识别驱动的结合，是共价配体开发的更有效起点。

**研究结论翻译**
综上所述，通过系统比较特异性设计结合靶蛋白的共价化合物与非特异性反应性共价结合剂，研究人员证明反应性单独并不驱动稳定化。稳定化需要存在非共价相互作用；然而，在这些非共价相互作用背景下的共价键可进一步稳定蛋白质，推测通过消除配体解离实现，尽管动力学研究应进一步支持这一假设。从实用角度，研究人员提出DSF作为亲电片段筛选的快速补充方法，用于优先选择生产性、选择性的共价结合剂，而非混杂反应性片段。