《Nature Metabolism》：Brown fat-specific RNA labelling reveals a network of inter-organ communication by secreted microRNAs
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细胞外微RNA（miRNAs）正逐渐成为机体稳态的关键调控因子。在本研究中，研究人员利用基于尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT）介导的4-硫尿嘧啶（4TU）掺入的雄性小鼠组织特异性RNA标记，绘制了miRNA从棕色脂肪组织（BAT）转移至其他组织（在这些组织中可
细胞外微RNA（miRNAs）正逐渐成为机体稳态的关键调控因子。在本研究中，研究人员利用基于尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT）介导的4-硫尿嘧啶（4TU）掺入的雄性小鼠组织特异性RNA标记，绘制了miRNA从棕色脂肪组织（BAT）转移至其他组织（在这些组织中可调节能量代谢）的路线图。研究人员发现，BAT通过小细胞外囊泡（sEVs）和与血浆蛋白结合两种方式分泌miRNAs，且这两个分室中的miRNAs在肝脏、肌肉和下丘脑表现出组织选择性摄取。在BAT中破坏Dicer导致BAT及远端组织中多种miRNAs显著减少，包括肌肉中最丰富的miRNAs下降80%–90%。靶标分析、体外建模以及体内肌肉中的PAR-CLIP分析证实，这些BAT分泌的miRNAs直接与靶mRNA相互作用，并改变受体组织中的线粒体功能。这些发现为理解BAT分泌的miRNAs在器官间通讯中的作用提供了一个框架。
**研究背景**
细胞外微RNA（miRNAs）作为机体稳态的关键调控因子日益受到关注。棕色脂肪组织（BAT）不仅通过产热消耗能量，还通过分泌多种生物活性分子（统称为“BATokines”，包括代谢物、蛋白质、脂质和miRNAs）对远端器官产生代谢益处。此前研究已表明，脂肪组织尤其是BAT是循环miRNAs的主要来源，部分BAT分泌的miRNA可被其他组织摄取并调控基因表达和代谢过程，例如miR-99b-5p和miR-378分别调节肝脏Fgf21表达和糖异生。然而，目前尚缺乏高通量体内直接证明miRNA在组织间转移的综合证据。为此，本研究基于组织特异性RNA标记技术，旨在系统描绘BAT来源miRNA的分泌载体、组织靶向性及功能意义，以阐明其作为内分泌调节因子的器官间通讯网络。该论文发表在《Nature Metabolism》。
**关键技术与方法**
研究人员主要采用以下关键技术：
1. **4TU/UPRT体内组织特异性RNA标记技术**：通过在BAT中特异性表达微生物尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT），使其掺入4-硫尿嘧啶（4TU）标记新合成RNA，结合链霉亲和素富集纯化BAT来源的4TU标记miRNA。
2. **血浆分馏与smRNA-seq**：利用尺寸排阻色谱（SEC）分离血浆小细胞外囊泡（sEV）和非sEV（蛋白质/脂蛋白结合）组分，对总RNA和4TU富集RNA进行小RNA测序（smRNA-seq）以鉴定BAT来源miRNA。
3. **PAR-CLIP（光交联免疫沉淀）**：在肌肉组织中对4TU标记的miRNA与Ago2-RISC复合物进行交联和共沉淀，验证BAT来源miRNA直接靶向靶mRNA。
4. **基因敲除小鼠模型**：构建BAT特异性Dicer敲除（BAT;DicerKO）小鼠，分析BAT miRNAs缺失对远端组织miRNA丰度及代谢功能的影响。
5. **体内电穿孔转染**：将编码miR-1a-3p的质粒直接电转至小鼠腓肠肌，以恢复miR-1表达并评估其对线粒体功能的影响。
所有实验使用8–12周龄雄性小鼠，UPRT转基因小鼠（Tg(CAG-GFP,-Uprt)985Cdoe/J）由O. Rando惠赠，Dicer-floxed小鼠和Ucp1-Cre小鼠购自Jackson实验室。
**研究结果**
**1. 利用4-硫尿嘧啶进行体内棕色脂肪特异性RNA标记及4TU-smRNA-seq分析**
通过BAT特异性表达UPRT（UCP1;UPRT小鼠），4TU掺入仅发生在BAT中。smRNA-seq显示，BAT中miRNAs占总小RNA的54%，而4TU富集部分中miRNAs占34%。BAT中4TU标记的miRNA丰度与其总miRNA丰度高度相关（R2=0.90），表明标记接近稳态。值得注意的是，传统认为是肌肉特异性“myomiR”的miR-1a-3p、miR-206-3p和miR-133a-3p在BAT中高度标记。
**2. 棕色脂肪分泌4TU miRNAs至小细胞外囊泡和非sEV相关血浆组分**
SEC分离血浆sEV和非sEV组分后，4TU-smRNA-seq鉴定出55种BAT来源的4TU miRNA，其中18种富集于sEV（如let-7f-2，miR-21a-5p），18种富集于非sEV（如let-7c-5p，miR-339-5p），19种均等分布于两者。序列基序分析发现，sEV富集的miRNA含有‘UCUKGG’基序，非sEV富集的miRNA含有‘CCUCCA’基序，而BAT中标记但未分泌的miRNA含有‘URCCU’等基序，提示miRNA分选依赖特定核苷酸基序。
**3. 追踪BAT来源的4TU miRNAs至肝脏、肌肉和下丘脑**
通过检测UCP1;UPRT小鼠各组织中的4TU标记RNA，发现BAT来源的4TU miRNA在肝脏、肌肉和下丘脑中显著积累，而在胰腺、脾脏和肾脏中水平极低或未检测到。
**4. 组织间转运路线图**
整合血浆和靶组织4TU miRNA数据，绘制出器官间转运路线图：55种BAT分泌的4TU miRNA中，17种富集于肌肉（包括miR-1a-3p、miR-206-3p），13种富集于肝脏（包括miR-122-5p、miR-148a-3p），25种富集于下丘脑（包括let-7家族成员）。肌肉中miR-1a-3p的4TU标记水平与BAT相当，肝脏中miR-122-5p的标记水平甚至超过BAT几个数量级，表明高通量转移。
**5. 棕色脂肪分泌的miRNAs在受体组织中发挥功能效应**
KEGG通路富集分析显示，肌肉富集的BAT miRNAs靶向FoxO及胰岛素信号通路；肝脏富集的靶向FoxO和TGFβ；下丘脑富集的靶向轴突导向和长期增强通路。体外转染实验表明，miR-1a-3p可显著抑制C2C12肌细胞中FoxO1蛋白表达（下降约80%），上调PGC1α和线粒体复合物III/IV，增加耗氧量和ATP产生。Ago2-RISC共沉淀实验证实miR-1a-3p与Foxo1 mRNA直接结合。
**6. BAT miRNAs缺失导致肌肉代谢功能障碍**
BAT;DicerKO小鼠（BAT特异性敲除Dicer）表现为BAT中miR-1a-3p下降约90%，肌肉中相应miRNA下降86%–91%，而原初转录本未降，证明肌肉中这些miRNA主要来源于BAT。肌肉出现线粒体含量减少、AMPK磷酸化降低、PGC1α及线粒体复合物蛋白下调，以及胰岛素刺激后Akt磷酸化减弱。然而，整体葡萄糖耐量和胰岛素敏感性无显著差异，提示缺陷局限在肌肉。
**7. BAT来源的miR-1通过靶向FoxO1功能性地调节肌肉线粒体生物合成**
采用PAR-CLIP技术，在UCP1;UPRT小鼠肌肉中特异性检测到4TU标记的BAT来源miR-1a-3p与Ago2-RISC复合物结合，且Foxo1 mRNA在该复合物中富集125倍。将miR-1a-3p质粒电转至BAT;DicerKO小鼠腓肠肌后，部分恢复miR-1a-3p水平，显著增加腓肠肌重量、线粒体DNA含量、线粒体面积和肌肉纤维横截面积，并降低FoxO1蛋白水平至正常。这表明BAT来源的miR-1a-3p通过抑制FoxO1促进肌肉线粒体生物合成。
**总结与结论**
研究人员利用组织特异性RNA标记技术证明，BAT产生的不同miRNA群体通过小细胞外囊泡和非囊泡载体释放入循环，并可差异性地转运至肝脏、肌肉和下丘脑。这些转移的miRNA显著贡献于受体组织中的miRNA池，能调节关键细胞功能（包括呼吸作用和基因/蛋白质表达）。尤其重要的是，研究人员提供直接证据表明BAT来源的miRNA被整合入远端组织的Ago2-RISC复合物中，证明转移的miRNA在远端组织中具有功能性。综上所述，研究数据表明BAT产生的miRNA是关键代谢调控因子，并提供了组织间miRNA转运的路线图。
