CRISPR-Cas9介导的蓝舌病病毒载体Culicoides sonorensis（蠓）中white基因的敲除

《Scientific Reports》：CRISPR-Cas9 mediated knockout of the white gene in the bluetongue virus vector, Culicoides sonorensis (biting midge)

　　

Culicoides蠓（biting midges）是小型吸血昆虫，负责传播重要的虫媒病毒（arboviruses），例如蓝舌病病毒（BTV）、施马伦贝格病毒（SBV）和流行性出血病病毒（EHDV），这些病毒对全球畜牧业造成重大损失。Culicoides sonorensis是北美BTV的主要传播媒介，也是少数能够在人工条件下驯化和饲养的Culicoides物种之一。基因编辑技术已被用于探索其他媒介群体（尤其是蚊虫）中的病毒-媒介相互作用。尽管自2018年以来已有参考基因组，但至今未有关于C. sonorensis基因编辑的报道。在此，研究人员报告了首次在C. sonorensis中实现的基因编辑，通过成年雌虫的胸部注射Cas9和靶向white基因的sgRNA完成。研究人员在white基因中产生了可遗传的突变，产生了白眼和红眼表型，并进一步建立了携带单一突变的纯合敲除品系。研究人员观察到高达12.3%的基因编辑效率，这为Culicoides蠓的遗传操作提供了一个高效方案，为功能基因组学研究以及针对这些重要且研究不足的疾病媒介制定控制策略打开了大门。

**论文解读文章**

**研究背景**
Culicoides蠓（biting midges）是多种重要虫媒病毒（arboviruses）的传播媒介，包括蓝舌病病毒（BTV）、施马伦贝格病毒（SBV）和流行性出血病病毒（EHDV）。这些病毒对全球畜牧业造成严重经济损失，例如BTV每年导致约30亿美元的损失。其中，Culicoides sonorensis是北美BTV的主要传播媒介，也是少数可在实验室条件下驯化和饲养的Culicoides物种之一，因此常被用作研究媒介-病毒相互作用的模型物种。尽管自2018年已获得参考基因组，但基因编辑技术在Culicoides中的应用严重滞后于其他媒介昆虫（如蚊虫）。此前通过胚胎显微注射进行基因编辑的尝试因胚胎体积小、对机械损伤敏感而导致存活率极低，未能成功。因此，亟需建立一种适用于C. sonorensis的高效基因编辑方法，以推动功能基因组学研究及新型防控策略的开发。本研究旨在通过成虫胸部注射Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物，首次在C. sonorensis中实现可遗传的基因敲除。论文发表在《Scientific Reports》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用了以下核心方法：1）通过胸部注射（Nanoject II微量注射器）将Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物递送至成年雌虫卵巢，注射时间控制在血餐后24小时内；2）使用GFP-Cas9荧光标记确认Cas9进入发育中卵母细胞的效率；3）重新注释white基因（CSON003308），修正原注释中的提前终止密码子，并利用CHOPCHOP平台设计三条靶向外显子3的sgRNA（sgRNA-ch1、-ch4、-ch6），经体外切割实验验证活性；4）配置不同浓度的Cas9（0.8–3.3 μg/μl）与sgRNA混合液，并添加皂苷（saponin）辅助RNP递送，注射后评估雌虫存活率及后代（G₀）的眼色素表型（马赛克眼、白眼）；5）通过Sanger测序和Inference of CRISPR Edits（ICE）工具解析突变类型，并利用基因型指导的遗传交配（单雄与野生型雌虫配对）分离纯合突变，建立稳定品系。实验所用C. sonorensis群体为实验室饲养品系，未注明特定来源。

**研究结果**
- **Cas9 must be intrathoracically injected within 24 h of a blood meal**
研究人员通过GFP-Cas9注射及卵巢荧光显微镜观察发现，血餐后24小时注射的雌虫中，97.1%（0.5 μg/μl组）和96.3%（1 μg/μl组）的存活个体卵巢呈现强荧光；而血餐后48小时注射的雌虫中，仅0%和5.0%的卵巢出现荧光（1 μg/μl组仅1只）。结果表明，Cas9仅能在血餐后24小时内通过胸部注射有效进入发育中的卵母细胞。

- **Intrathoracic injections enable genome editing in C. sonorensis**
使用靶向white基因的sgRNA-Cas9 RNP进行胸部注射后，研究人员在G₀代幼虫中观察到马赛克眼和白眼表型（图2b）。不同注射混合物中，最高Cas9浓度（3.3 μg/μl）产生的编辑效率最高（12.3%），但雌虫死亡率也最高（75%）；较低Cas9浓度（0.8 μg/μl）时编辑效率显著下降（0–2.7%）。结果显示，该方案可在C. sonorensis中实现有效基因编辑，且编辑效率与Cas9浓度相关。

- **Cas9-induced mutations in the white gene are heritable**
将G₀代马赛克眼和白眼科成虫混合饲养并互交后，G₁代出现黑眼、红眼和白眼三种表型。Sanger测序和ICE分析显示，白眼表型与多个移码突变相关（包括4、5、10、14、27 bp缺失），大部分位于sgRNA-ch1结合位点；红眼表型与一个框内突变相关（6 bp缺失导致L86和D87缺失，以及Y88C和M89V替换）。蛋白质结构预测表明，红眼突变可能改变细胞质区域结构，但不影响跨膜结构域。研究人员进一步通过基因型筛选，从G₅代雄性中鉴定出一个携带纯合10 bp缺失（引起外显子3中的提前终止密码子）的个体，该品系（w^?10）已稳定维持超过15代。

**讨论部分总结**
本研究证实，胸部注射Cas9-sgRNA复合物可在C. sonorensis中产生可遗传突变，且通过基因型指导的遗传交配可分离特定等位基因以建立纯合敲除品系。最高编辑效率（12.3%）高于多数已报道的成虫注射方法（如蚊虫等），但低于德国小蠊（21.8%）、灰飞虱（56.7%）和赤拟谷盗（71.4%），提示存在优化空间（例如加入分支两亲性肽胶囊BAPC可增强RNP递送）。红眼突变可能通过影响White蛋白的核苷酸结合域（NBD）选择性损害棕色色素前体转运，但需进一步实验验证。此外，建立的白眼标记品系可用于共CRISPR策略，即同时注射靶向目的基因和标记基因座的sgRNA，通过筛选标记表型富集靶位点编辑事件，已在果蝇、埃及伊蚊等物种中成功应用。

**研究结论翻译**
总之，本研究呈现的结果为这一重要媒介物种中CRISPR介导的基因敲除建立了一个通用平台。结合方法中概述的饲养方案，这些进展为未来的功能基因组学研究提供了基础，增强了研究人员调查并最终管理影响该重要媒介群体媒介能力和病原体传播的性状的能力。