高效化学重编程人类T细胞为功能性巨核细胞和血小板

《SCIENCE ADVANCES》：Efficient chemical reprogramming of human T cells into functional megakaryocytes and platelets

　　

通过化学重编程从人类体细胞生成巨核细胞（megakaryocytes，MKs）是一种开发替代血小板来源的有前景策略。基于研究人员之前将成红细胞转化为MKs的化学重编程方案，研究人员建立了一种稳健的方法，成功从人类脐带血来源的CD3⁺T细胞（一种更丰富的来源）生成了诱导型巨核细胞（induced MKs，iMKs）。该方法使用了一种包含重编程增强剂AZD4205的五种小分子混合物，以促进T细胞身份清除并加速向MKs的细胞命运转变。T细胞来源的iMKs表现出典型的MK细胞和分子特征，具有产生前血小板（proplatelets）和释放功能性血小板的能力。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）进一步揭示，iMKs具有异质性，包含不同的功能亚群，包括增殖型（cycling）、免疫型（immune）和偏向血小板生成型（thrombopoiesis-biased）的MKs。研究人员的发现突显了一种优化的化学重编程策略，能够高效地将T细胞转化为MKs，为生成临床相关的MKs和血小板提供了一种实用且便捷的方法。

**论文解读：高效化学重编程人类T细胞为功能性巨核细胞和血小板**

**研究背景与问题**
血小板输注是严重血小板减少症患者的关键生命支持疗法。目前，血小板制品主要依赖志愿者的全血捐献，但健康供者数量有限、血小板保质期短且易受污染，导致血小板供应严重受限。此外，许多患者需要反复输注，进一步加剧了供需失衡。近年来，干细胞研究和再生医学的快速发展为缓解临床血小板短缺提供了新思路，特别是利用干细胞诱导分化和细胞重编程技术，可在体外生成巨核细胞（megakaryocytes，MKs）和血小板，有望满足对血小板产品日益增长的需求。直接谱系重编程技术通过过表达特定转录因子（transcription factors，TFs）可将小鼠或人类体细胞转化为造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）、红系祖细胞及MKs，但基于TF的重编程涉及基因操作，存在安全性问题，限制了其临床应用。相比之下，小分子化合物具有显著优势，可完全替代TFs将体细胞转化为目标细胞，包括诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、HSPCs、内胚层祖细胞、神经元和心肌细胞等。研究人员先前报道，四种小分子混合物（4M：Bix01294、RG108、PD0325901和丙戊酸（VPA））可将脐带血成红细胞重编程为产生血小板的MKs。这一发现促使研究人员探索能否利用更丰富且易获取的T细胞，通过化学重编程获得MKs。T细胞占脐带血或外周血单个核细胞的40%–70%，是体外生成MKs的理想起始材料。因此，本研究旨在建立一种高效、安全的化学重编程策略，将T细胞转化为功能性MKs和血小板，以解决血小板供应问题。

**研究内容与结论**
研究人员在先前4M化学重编程方案（用于成红细胞向MKs转化）的基础上，通过高通量小分子筛选，发现Janus激酶1（JAK1）抑制剂AZD4205能显著增强T细胞向MKs的化学重编程。优化后的方案（4M+AZD，即5M）可从脐带血CD3⁺T细胞高效生成诱导型MKs（iMKs）。T细胞来源的iMKs表现出典型的MK特征，包括多叶核、分界膜系统、颗粒及MK特异性标志物表达，并能在体外形成前血小板（proplatelets）和释放功能性血小板样颗粒。单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示了iMKs的异质性，鉴定出四个亚群：增殖型MKs（iMK1）、免疫型MKs（iMK2和iMK3）以及偏向血小板生成型MKs（iMK4）。伪时间轨迹分析进一步阐明了iMKs异质性的发育起源，发现存在一条偏向血小板生成的路径和一条经过诱导通用髓系祖细胞（iCMPs）中间状态的路径。功能上，iMKs在体外产生的前血小板能释放具有激活和凝血功能的血小板。体内移植实验证实，将iMKs输注至血小板减少症小鼠后，可在其外周血中检测到功能性人类血小板，并响应激动剂活化。该研究发表在《SCIENCE ADVANCES》。

**关键技术方法**
研究人员使用高内涵成像筛选平台对320种小分子化合物进行筛选，以鉴定增强T细胞向MKs转化的候选化合物。主要技术包括：流式细胞术检测MK标志物（CD41a、CD42b）表达；bulk RNA-seq分析转录组变化；单细胞RNA测序（scRNA-seq，10x Genomics平台）解析细胞异质性和分化轨迹；体外前血小板形成和血小板功能检测（免疫荧光、电镜、血小板活化实验）；体内小鼠模型（NVSG小鼠，经2.5 Gy照射诱导血小板减少症）评估iMKs的分布和血小板释放能力。样本来源为北京脐带血库的健康足月分娩脐带血，分离CD3⁺T细胞（新鲜或冻存）。

**研究结果**
**AZD4205 enhances chemical reprogramming of human T cells to iMKs**
通过将AZD4205添加至基础4M混合物（4M+AZD），与单独4M相比，显著提高了iMKs的产量：第14天时CD41a⁺细胞比例达68.13%±0.75%，CD41a⁺CD42b⁺细胞比例达42.6%±1.08%。AZD4205上调了MK相关TF基因（如RUNX1、MEIS1、FLI1、GATA1、GATA2）和标志基因（ITGA2B、ITGB3），同时下调了T细胞特异性基因（如CD3E、IL7R、RUNX3、BCL11B、GATA3）。形态学上，4M+AZD组前血小板数量显著增加。

**AZD4205 drives T cell–to–MK conversion by suppressing JAK/STAT and activating WNT signaling**
bulk RNA-seq分析显示，AZD4205处理组中T细胞发育和激活相关基因（如ETV7、BATF3、IL13、IL21、CXCL8等）下调，而WNT信号通路相关基因上调。基因本体（GO）富集分析表明，下调基因富集于免疫系统过程、NF-κB信号通路、JAK/STAT级联等；上调基因富集于WNT信号通路和β-catenin-TCF复合物组装。WNT抑制剂XAV939和IWR-1可抵消AZD4205对MK重编程效率的增强作用，并下调MK关键TF和标志基因。

**T cell–derived iMKs display typical MK characteristics**
iMKs表现出典型MK形态（多叶核、丰富胞质、颗粒积累）、超微结构（分界膜系统、多泡体、成熟颗粒）和核内复制（约14%的CD41a⁺CD42b⁺ iMKs DNA含量≥4N）。免疫荧光显示CD41、CD42b、PF4、THBS1表达。转录组分析表明，MK相关TF和标志基因上调，T细胞相关基因下调，血小板功能相关基因（DMTN、PF4、CLEC1B、THBS1）表达升高。iMKs在凝血酶刺激后上调CD62P，表明具有脱颗粒能力。

**scRNA-seq analyses reveals MK fate commitment dynamics and transcriptional heterogeneity within iMKs**
scRNA-seq捕获35,328个细胞，经UMAP聚类鉴定出四个簇：C1（初始T细胞，表达TCF7、BCL11B等）、C2（炎性T细胞，表达IL1B、CCL3等）、C3（诱导通用髓系祖细胞，iCMPs，高表达ELANE、PRTN3、CEBPA、MPO、MYB、FLI1，处于增殖状态）、C4（iMKs，高表达MEIS1、GATA2、ITGA2B、PF4等）。对C4中7,515个iMKs再次聚类，获得四个亚群：iMK1（增殖型MKs，高表达PCNA、MKI67，G2M/S期占比高）、iMK2和iMK3（免疫型MKs，高表达HPGD、HPGDS、ANXA1、IL1RL1、CD44、CD53，富集免疫应答相关通路）、iMK4（偏向血小板生成型MKs，高表达PPBP、PF4、THBS1、CLEC1B、TUBB1、GP9，富集血小板活化和凝血通路）。该异质性与自然MKs相似。

**Pseudo-time trajectory analysis reveals distinct transcriptional dynamics in iMK reprogramming**
伪时间轨迹分析显示，iMKs沿两条主要方向分化：方向1主要包含iMK4（偏向血小板生成），方向2包含iCMPs、iMK2和iMK3。分支表达分析（BEAM）鉴定出三个基因模块：模块1包含血小板激活和MK发育相关基因（如GP1BA、SELP、F2R、PF4），沿方向1上调；模块2包含T细胞发育基因（如BACH2、BCL11A、FOXP1、LEF1、RUNX3），沿两个方向均下调；模块3包含髓系相关基因（如ELANE、MPO、PRTN3）和增殖基因（PCNA），沿方向2先上调后下调，免疫相关基因（HPGDS、IL18R1）沿方向2上调。TF网络分析显示模块1富含FLI1、MEIS1、GATA2、NFE2等血小板生成TF；模块2富含BACH2、LEF1、FOXP1等T细胞TF；模块3富含细胞周期和髓系相关TF（DACH1、CENPA、WDHD、NFIA、HMGB2、ERG、MYB）。

**T cell–derived iMKs produced proplatelets and platelets in vitro**
iMKs在成熟培养基中培养7天后，部分细胞形成具有典型前血小板形态的突起（多分支、串珠状结构），表达CD41、CD42b、vWF、THBS1，肌动蛋白网络重建。收集的上清液中存在血小板样颗粒（iMK-PLTs），电镜显示开放管道系统和α颗粒。iMK-PLTs在凝血酶或ADP/TRAP刺激后上调CD62P，并能形成和回缩纤维蛋白凝块，表明具有凝血功能。每个iMK平均产生约17.56±1.92个血小板样颗粒。

**In vivo platelet production of iMKs in thrombocytopenic mice**
DiD标记的iMKs经尾静脉输注至2.5 Gy照射的免疫缺陷小鼠后，活体荧光成像显示初始滞留于肺，3小时后向其他器官迁移，24小时后在肺、脾、肝、骨髓中检测到。流式细胞术证实肺中嵌合率最高。外周血中人类CD41a⁺血小板在输注后1小时出现（0.48%±0.04%），3小时达峰（2.32%±0.38%），随后逐渐下降。ADP刺激后，这些血小板CD62P表达显著升高，表明具有活化能力。

**讨论与结论**
本研究建立了一种高效的化学重编程策略，将人类脐带血CD3⁺T细胞转化为功能性MKs和血小板。T细胞来源的iMKs具备典型MK特征，包括细胞形态、超微结构、标志物表达和转录组谱。scRNA-seq揭示了重编程过程中出现iCMP中间态，并发现iMKs的异质性亚群（增殖型、免疫型、偏向血小板生成型）。体外和体内实验均证实iMKs能产生功能性血小板。该方案通过抑制JAK/STAT信号清除T细胞身份，同时激活WNT信号促进MK命运获取，为按需生产MKs和血小板提供了有前景的策略。研究结论：研究人员建立了一种从脐带血T细胞高效生成人类MKs和血小板的化学重编程方案。T细胞来源的iMKs展现了真实MKs的标志性细胞和遗传特征，包括异质性（增殖型、免疫反应型、偏向血小板生成型）。值得注意的是，iMKs在体内外均能形成前血小板并释放功能性血小板。因此，化学重编程T细胞为iMKs为按需生产功能性MKs和血小板提供了一种有前景的策略，有望减轻输血依赖、减少出血并发症并改善难治性血小板减少症患者的预后。然而，目前研究的一个局限性是，尽管化学重编程实现了较高的细胞命运转化效率（约1个iMK/输入T细胞），但随后的血小板释放效率（每iMK约17.56±1.92个血小板）仍相对较低，这是体外血小板制造中公认的技术挑战。因此，迫切需要进一步优化血小板生成条件并开发先进生物反应器系统，以提高血小板产量并促进未来的转化应用。