《Cancers》：Advancing Liquid Biopsy: First Clinical Demonstration of Bio-Ferrography for Isolation and Microscopic Characterization of EGFR-Positive Circulating Tumor Cells in Metastatic Cancer
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背景：结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，亟需改进的非侵入性诊断和监测工具。循环肿瘤细胞（CTC）作为液体活检中的完整细胞生物标志物，提供有价值的形态学和遗传学信息，在早期检测、预后、治疗监测和药物开发方面具有重要临床潜力。生物铁谱技术（Bio
背景：结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，亟需改进的非侵入性诊断和监测工具。循环肿瘤细胞（CTC）作为液体活检中的完整细胞生物标志物，提供有价值的形态学和遗传学信息，在早期检测、预后、治疗监测和药物开发方面具有重要临床潜力。生物铁谱技术（Bio-Ferrography）是一种非侵入性免疫磁分离（IMS）技术，通过聚焦外磁场将磁标记实体从流体样品中隔离到玻璃基板上。方法：研究人员在研究中首次采用生物铁谱技术，从住院患者的血液活检中分离、计数和显微表征表达人表皮生长因子受体（EGFR）的循环肿瘤细胞（CTC）。使用偶联抗EGFR抗体的磁珠从转移性CRC和其他上皮恶性肿瘤患者的外周血样本中选择性捕获CTC。该方法实现了对分离细胞的计数和显微表征。结果：初步临床结果表明，生物铁谱技术在IV期患者中的敏感性达到90%，并且与包括糖类抗原19-9（CA 19-9）和癌胚抗原（CEA）在内的常规肿瘤生物标志物相比，表现出更高的真阳性检出率。结论：这些发现凸显了生物铁谱技术作为CTC分离和分析稳健平台的潜力。
研究背景方面，结直肠癌（CRC）是全球第三大常见男性癌症和第二大常见女性癌症，也是第二大癌症相关死亡原因，约30至50%的患者会发生局部复发或远处转移，早期确诊五年生存率可达90%而转移性疾病的五年生存率降至14%，现有诊断技术如结肠镜检查和愈创木脂粪便潜血试验（gFOBT）存在侵入性高、成本高、假阳性率高、需肠道准备及可能遗漏小息肉等缺陷，液体活检作为微创可重复方法通过分离外周血中的循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、RNA和蛋白质等进行枚举与分析具有优势，但CTC在血液中极其罕见（每109血细胞中约1至10个），形态变异大，半衰期短（约1至2.4小时），现有免疫磁分离（IMS）技术如FDA批准的CellSearch?存在仅能捕获上皮细脆黏附分子（EpCAM）阳性细胞、封闭系统仅提供计数无法便捷获取细胞进行分子形态学表征、敏感性低（CRC约30%）、通量低、成本高及需熟练操作人员等缺点，生物铁谱技术（Bio-Ferrography）源于机械磨损颗粒分析的铁谱技术，经改良用于从体液中隔离靶生物物质如细胞和组织碎片，具备高选择性敏感性、高回收率、可定量分析与显微观察、保存结构形态、沉积区域小、适用于全血且可捕获纳米级颗粒等优势，此前已在细菌追踪、骨关节炎诊断等成功应用并在细胞系实验中实现高达97%的CTC回收率，但在临床患者血液活检中的应用尚未被证实，因此研究人员开展此项可行性研究，旨在首次将生物铁谱技术用于医院患者血液活检中CTC的分离计数与显微表征及细胞学分析，该研究发表于《Cancers》。
关键技术方法方面，研究人员使用来自特拉维夫苏拉斯基医疗中心综合癌症预防中心的48例癌症患者的54份血液样本（最终分析43例患者49份样本，含胃肠道癌及其他上皮恶性肿瘤，分期涵盖0至4期及未知分期），并以以色列MDA血液服务提供的3名健康供体全血为阴性对照，以稳定表达mCherry红色荧光蛋白的A431表皮样癌细胞系为EGFR过表达阳性对照并在部分通道加标100个细胞，采用抗EGFR小鼠抗人IgG抗体与抗小鼠IgG磁珠偶联孵育后，使用Bio-Ferrograph 2100仪器在磷酸盐缓冲液（PBS）中以0.1 mL/min流速进行磁分离，样本经4%多聚甲醛固定后行苏木精和伊红（H&E）染色由专家病理学家依据7类细胞类别进行形态学分析，分离流程分初步阶段、筛选阶段和优化验证阶段基于实验设计（DOE）方法，回收率通过计算分离细胞数与输入细胞数之比得出。
研究结果部分保留小标题如下：
- 3.
Results：敏感性分析显示I期CRC患者分类为1B，II期为1B，III期7例中2例因保存不良取消资格、其余分别为0、1A、2、3类，IV期23例中4例取消资格、其余分布为0类6例、1A类1例、1B类1例、2类2例、3类9例，按DOE阶段区分优化验证阶段（O）IV期分类3类达8/9而筛选阶段（S）0/2、初步阶段（P）1/8，总体优化验证阶段在IV期上皮癌中敏感性达90%；代表性显微形态显示分离细胞具备CTC特征如体积增大、核质比增高、核膜凹陷或突起、深染核、聚集及有丝分裂现象，并能观察到CTC簇（aggregates）；阴性对照中3名健康供体全血均未发现可疑癌细胞特异性达100%（3/3，截断值0），非上皮肿瘤（胰腺、十二指肠）患者分类为0和1B未见可疑恶性细胞，支持EGFR捕获的特异性；阳性对照中加标A431细胞在优化阶段回收率测得57%至97%，非CRC患者血中亦测得93%和94%；部分样本因采血后运输储存处理导致细胞保存不良呈模糊胞质轮廓无法判读而被排除分析。
讨论部分总结：研究人员回顾既往细胞系实验生物铁谱技术经DOE优化验证阶段回收率可达97%且所需血样仅1 mL，本临床研究在优化阶段对IV期上皮癌敏感性达90%优于CA 19-9、CEA、甲胎蛋白（AFP）等常规肿瘤标志物，阴性阳性对照符合预期，相较于CellSearch?依赖EpCAM捕获受上皮间质转化（EMT）和肿瘤异质性限制敏感性约30%，生物铁谱平台可检测更广泛癌症相关细胞与免疫特征；但目前存在捕获可疑癌细胞数量少、部分样本保存不良影响免疫荧光、仅用EGFR生物标志物覆盖约49至82% CRC、需更大人群包括早分期验证等不足，未来可通过增加样本体积、优化染色、引入人工智能（AI）与机器学习（ML）、标准化样本处理、拓展其他生物标志物如EpCAM、细胞角蛋白CK8/CK18/CK19、MUC1等改进；研究人员指出ctDNA虽易检测可提供基因组信息但存在假阳性假阴性、背景噪声、短时处理限制、浓度与健康重叠、难比较平台结果及无法培养等局限，CTC作为完整细胞可提供形态蛋白RNA信息且可培养用于药敏，二者互补分别反映转移起始细胞与肿瘤负荷，CTC分离仍面临稀有性、形态变异性、标记多样、短半衰期及转移与非转移CTC区分挑战；结论部分翻译为：本研究证明了生物铁谱技术结合表皮生长因子受体（EGFR）生物标志物用于从住院患者血液活检中分离、计数和显微表征循环肿瘤细胞（CTC）以监测结直肠癌（CRC）和其他上皮恶性肿瘤的适用性，初步结果显示基于优化验证的实验设计（DOE）方案对IV期患者敏感性达90%同时具备卓越特异性且仅需1 mL血液，值得注意的是生物铁谱技术在检测III期和IV期癌症的成功率显著高于CA 19-9、CEA和AFP等常规肿瘤标志物，本研究为进一步研发铺平道路，未来可能实现生物铁谱基仪器在临床常规用于癌症监测的液体活检。
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