利用氧荧光淬灭技术对微孔中甲藻光合作用与呼吸速率的实时测量

《Algal Research》：Real-time measurements of dinoflagellate photosynthesis and respiration rates in microwells using oxygen luminescence-quenching

　　

艾米丽·S·乔利|米兰达·贾德|延斯·维拉|格雷格·M·西尔斯比|艾伦·R·普莱斯

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  红色（和白色）光会显著影响通过Resipher获得的氧气测量结果。
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  Resipher能够在过饱和条件下继续检测氧气含量。
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  Resipher的氧气测量结果与细胞密度相关。
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  基于Resipher得出的光合作用速率与碳固定速率一致。
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  叶绿体呼吸是甲藻中主要的呼吸途径。

引言

目前有几种方法可用于估算水生藻类的光合作用和呼吸作用速率，其中两种尤为常用。第一种方法是利用碳同位素分析来测定卡尔文循环中的碳固定过程[1]，另一种则是使用克拉克型电极来检测光反应产生的氧气量[2]。碳同位素分析通过测定碳同位素（¹¹C、¹³C和¹⁴C）在生物量中的含量，来估算光合作用的碳固定速率[3]。但由于该方法仅依赖于碳固定过程，因此无法反映用于支持其他增加ATP生成反应的光能利用情况[4]，所以它只能揭示特定物种部分代谢过程的信息。而克拉克型电极则可以检测光反应产生的氧气，或是各种呼吸途径消耗的氧气。其工作原理是氧气在阴极处被还原，从而产生与样本中氧气浓度成正比的电压[5]。不过，克拉克型电极并不总是理想的选择，因为其测量过程中对氧气的消耗缺乏精确度，且需要相对较大的样本体积[3]。

近期的一些研究显示，在较小样本体积下进行光合作用和呼吸作用测量具有诸多优势。约翰逊和谢尔顿开发的微光合仪[6]利用¹⁴C技术，在96孔微板上同时测量不同光照强度下的光合作用情况，从而绘制出光合作用-光照强度曲线。这些研究者发现，使用较小样本体积不仅能够优化能源使用和实验室空间，还能提高测量灵敏度，便于针对海洋中常见的低生物量、低生产力环境开展重复实验。此外，这种方法还提升了样本处理效率，使得可以从同一单培养物中同步收集多个处理组的数据[6]。

Resipher是一种由Lucid Scientific公司开发的细胞培养监测设备，可通过持续检测氧气含量来估算净光合作用和呼吸作用强度。该设备可在20℃至45℃的温度范围内，每分钟检测一次96孔板中底部100微升区域的溶解氧浓度，最长可连续检测30天。其系统包括一个96孔板、一个装有32个氧气探测器的盖子，以及一个与盖子相连的设备，该设备负责记录数据，并将数据传输到一个可在线访问的8端口集线器上。盖子中的每个探测器都包含一个LED灯，能在435到485纳米的波长范围内激发铂复合体（见图1）。这种被激发的铂复合体会被氧气淬灭，因此其荧光强度或衰减时间可通过斯特恩-沃尔默关系与样本中的氧气浓度相关联[7]。

尽管Resipher能够提供高分辨率的时间序列测量数据，但目前它主要被用于检测哺乳动物和细菌细胞培养物中的呼吸作用速率。此外，它还从未在光照条件下被用于测量光合作用速率或光驱动的氧气消耗情况。这些铂复合体的激发光谱范围大约在350到550纳米之间，因此理论上，任何处于这一波长范围内的光源都会持续产生信号。另外，该设备还配备了一个低通滤光片，可阻挡波长小于560纳米的光线进入检测器，因此所测得的荧光峰值大约在610纳米处（见图1）[8]。因此，有必要研究不同光照强度和波长对测量结果的影响，以此判断该设备在检测藻类单培养物的光合作用方面的适用程度。

此前已有研究使用光学氧气传感器来检测甲藻的呼吸作用[9]。虽然与前述方法类似，这类方法也存在样本处理效率低以及只能在黑暗条件下检测的局限，但本研究表明，甲藻非常适合采用光学传感技术来进行氧气相关研究。甲藻属于孢子虫门中的单细胞真核生物，它们拥有极其多样的营养策略，包括捕食、光自养、混合营养和细胞内寄生等[10]、[11]。许多光合作用型的甲藻因其在有害藻华形成[12]、毒素合成[13]、生物发光[14]以及与刺胞动物的共生关系[15]等方面的作用而备受关注。无囊甲藻*Amphidinium carterae*因其基因组规模相对较小且易于培养，常被用作含周藻红素的甲藻模型物种[16]。此外，自由生活的*Symbiodinium natans*属于苏埃西亚目中物种数量最多的共生藻科[17]。这两种物种均为底栖、能移动、具有光合作用能力且能产生毒素，因此是检测甲藻光合作用和呼吸作用的理想对象。本研究旨在：（1）评估Resipher系统在模拟藻类生理实验条件下的适用性，包括不同的光照环境和多种氧气浓度；（2）考察Resipher在不同条件下检测甲藻光合作用和呼吸作用速率的能力，包括在代谢抑制剂存在时的表现；（3）将Resipher的测量结果与二氧化碳固定、PAM荧光分析法以及色素分析等传统光合作用性能评估指标进行对比。

章节摘要

细胞培养条件

*Amphidinium carterae*（Hulbert）CCMP 1314菌株在不含硅酸盐的32‰ f/2培养基中培养，培养温度为24℃，光照与黑暗周期为14:10小时，光照强度为100微摩尔光子/平方米·秒[18]。*Symbiodinium natans* CCMP 2548菌株则在32‰ f/2培养基中于27℃下培养，光照强度为30微摩尔光子/平方米·秒，光照与黑暗周期为12:12小时[17]。两种培养物均在含有卡那霉素（50微克/毫升）、羧苄青霉素（100微克/毫升）和壮观霉素（50微克/毫升）的抗生素溶液中培养[19]。

光照处理

连接到盖子上的设备可阻挡

光照对氧气测量的影响

背景光会显著影响Resipher设备检测到的氧气浓度。在所有光照强度下，白天与夜间培养的未添加藻类的测试介质中的氧气浓度存在显著差异（F_1,114=21.974，P<0.0001；见图3a）。此外，通过带有指数生长模型的非线性回归分析发现，光照存在时氧气浓度的下降程度与背景光强度呈正比

Resipher的优势

本研究结果表明，Resipher系统适用于在多种条件下检测与甲藻光合作用和呼吸作用相关的氧气动态变化。首先，该设备能够捕捉具有生物学意义的氧气动态变化。释放氧气的试剂片会使溶解氧浓度从环境水平上升至约430微摩尔/氧分子浓度，且在饱和状态之上仍能保持稳定的测量值（见图SM3）。观察到的浓度平台期

结论

本研究表明，由Lucid Scientific公司开发的Resipher设备能够检测甲藻培养物中的氧气浓度，这一功能有助于分析氧气的产生与消耗速率。不过，与其他光合作用检测方法一样，Resipher技术也存在一定的局限性。这些实验中使用的较小样本体积虽然提升了样本处理效率并增强了实验重复性，但同时也使得样本处于过饱和状态，这限制了

CRediT作者贡献说明

艾米丽·S·乔利：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，软件应用，方法设计，实验实施，正式分析，概念构思。米兰达·贾德：写作——审阅与编辑，方法设计，实验实施，概念构思。延斯·维拉：写作——审阅与编辑，可视化，软件应用，方法设计，实验实施，概念构思。格雷格·M·西尔斯比：写作——审阅与编辑，方法设计，实验实施，概念构思。艾伦·R·普莱斯：写作——审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关联或个人关系。

致谢

本研究得到了IMET天使投资人以及NOAA-NOS-NCCOS的HCI项目：USHAB-CTI（美国有害藻华控制孵化器）的支持。特别感谢乔安妮·萨尔泽在培养物维护和实验设置方面所提供的帮助。同时，我们也感谢Lucid Scientific公司的理查德·布赖恩及其团队在协助解读Resipher设备输出数据方面给予的帮助。