《mSphere》：Acquisition of a gene cluster in Clostridioides difficile PCR ribotype 023 strains enables xylitol utilization
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过去三十年来，数百种胃肠道病原体艰难梭菌（Clostridioides difficile）的PCR ribotype（核糖体型）不断涌现，然而驱动其出现的因素尚不清楚。近期，欧洲由PCR ribotype 023（RT023）菌株引起的感染有所增加。研究人员
过去三十年来，数百种胃肠道病原体艰难梭菌（Clostridioides difficile）的PCR ribotype（核糖体型）不断涌现，然而驱动其出现的因素尚不清楚。近期，欧洲由PCR ribotype 023（RT023）菌株引起的感染有所增加。研究人员分析了七株RT023菌株在190种独特碳源中的生长谱，发现它们能够在木糖醇（一种用于人类和动物食品添加剂的糖醇）中生长。其他测试的艰难梭菌核糖体型（n = 19）在0.5%木糖醇中几乎不生长，且在更高浓度木糖醇中生长受抑制。基因组测序鉴定出RT023菌株在一个其他核糖体型缺失的移动遗传元件（Mobile Genetic Element, MGE）中获得了一个推定的木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase, xdh）基因。研究人员在RT023菌株PRB1128中创建了xdh缺失突变体，观察到其在木糖醇中生长不良，表明xdh是木糖醇利用所必需的。利用基于质粒的诱导型xdh基因拷贝对xdh突变体进行回补，恢复了其在木糖醇中的生长。研究人员在微型生物反应器阵列（Minibioreactor Arrays, MBRAs）中进行竞争实验，观察到在木糖醇存在下PRB1128优于非木糖醇利用菌株CD2015（RT027）。这些数据支持RT023菌株内的xdh基因在为木糖醇生长提供适应性优势方面的作用。有趣的是，MGE插入的染色体位点似乎是艰难梭菌各分支间遗传插入的热点。总之，这项工作增进了研究人员对艰难梭菌生态位适应分子基础的理解。
研究背景与概述
艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种革兰氏阳性产毒厌氧菌，是最常见的医院相关性胃肠道感染病原体之一，自2000年以来感染率上升，部分归因于抗生素使用破坏内生肠道菌群。该病原菌基于全基因组序列分析通常分为五个系统发育分支（clade），特定核糖体型表现出严重疾病、高发病率和死亡率。自2008年以来，分支3（clade 3，以PCR ribotype 023即RT023为主）菌株在英国及欧洲医院中出现并引起严重疾病。RT023菌株具有独特的致病岛（PaLoc）结构、编码二元毒素及四基因海藻糖簇，具有糖基化S层蛋白、高度体外运动性等特征，且在多种碳源中生长较差。木糖醇（xylitol）是一种五碳糖醇，天然存在于果蔬中，作为低热甜味剂广泛用于食品，人体日产5–15 g，摄入后50%进入结肠可被部分菌群代谢为短链脂肪酸，其余具保水通便效应；多数细菌因无法代谢木糖醇而受其毒性影响，木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase, xdh，EC: 1.1.1.9）负责将木糖醇转化为木酮糖进入磷酸戊糖途径等代谢。目前关于艰难梭菌新兴的遗传驱动因素知之甚少，研究人员旨在探究RT023菌株潜在的分子特征以理解其适应性。该论文发表于《mSphere》。
主要关键技术方法
研究人员选用26株涵盖五个分支的艰难梭菌临床分离株（含7株RT023及其他19株非RT023核糖体型如RT002、RT014、RT027、RT078等）。利用Biolog表型微阵列分析190种碳源生长谱；进行全基因组测序比对GC含量及基因注释；采用CRISPR/Cas12a（AsCpf1）系统构建PRB1128菌株的xdh基因缺失突变体（?xdh）并通过共轭转移及诱导质粒 curing验证，利用pRPF185衍生质粒构建无水四环素（anhydrotetracycline, aTc）诱导型回补菌株（?xdh, PaTc-xdh-cat）；使用微型生物反应器阵列（Minibioreactor Arrays, MBRAs）进行连续流稳态竞争实验（PRB1128/CD2015及?xdh/CD2015）及克林霉素（clindamycin）处理的体外人粪菌社区定植实验；采用定量PCR（qPCR）以thyX与thyA为分支特异性引物计算竞争指数（Competitive Index, CI）；利用AlphaFold进行蛋白质结构预测比对；通过16S rRNA测序（V3–V4区）分析菌群组成；使用化学限定最小培养基（Chemically Defined Minimal Medium, CDMM）及BRM3培养基进行批次生长曲线测定（OD600）。
研究结果
RT023 strains grow in xylitol, while xylitol is detrimental to growth of non-RT023s
研究人员通过Biolog分析及批次生长实验评估碳代谢谱，确认七株RT023在补充0.5%木糖醇的化学限定最小培养基（CDMM）中能够生长，其中两株可在5%木糖醇中生长；非RT023菌株在0.5%木糖醇中仅有微弱生长且高浓度下受抑制。归一化曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）热图显示RT023在0.5%木糖醇中呈碳支持性生长（AUC > 1.0），与非RT023相比具显著差异（Wilcoxon秩和检验，P < 2.2E?16），表明RT023具备独特的木糖醇代谢能力。
RT023 strains acquired a putative xylitol dehydrogenase within a mobile genetic element (MGE)
研究人员通过基因组分析在RT023特有的一段高GC含量（38% vs 基因组28%）区域鉴定出一个注释为苏氨酸脱氢酶但实际为推定木糖醇脱氢酶（xdh）的基因，位于移动遗传元件（MGE）内，该MGE还编码XRE家族转录调节因子、假设蛋白及重组酶，并插入至螺旋-转角-螺旋（Helix-Turn-Helix, HTH）转录调节因子基因使其断裂为两段（CDIF102859_RS08995和RS09030），而RT027菌株R20291中该基因完整（WP_018112778）。AlphaFold结构预测显示该推定Xdh与酵母XYL2（UniProt: Q07993）结构相似（RMSD: 1.798 ?），底物特异性、辅因子结合及锌配位残基保守，故命名为xdh。在PRB1128中删除xdh后，0.5%木糖醇中培养8小时光密度显著低于野生型（P < 0.05）；诱导型回补菌株在不诱导时与突变体无差异，诱导后在木糖醇中恢复野生型生长表型，证实xdh为RT023木糖醇利用所必需。
The mobile genetic element (MGE) locus is a hotspot for genetic diversity across C. difficile
研究人员比对各分支艰难梭菌该基因组位点，发现分支1（RT010）及分支4（CD161）中亦存在不同组成的MGE插入该HTH转录调节因子位点，分支2（如CD630、R20291）则该基因完整；其他RT023菌株（DSM 102978、DSM 102860）均保守含有PRB1128的MGE，表明该位点为艰难梭菌跨分支遗传多样性的热点插入位点。
The xdh-containing MGE was likely horizontally transferred from other gut bacteria
研究人员通过BLAST比对NCBI核苷酸数据库，发现MGE中的XRE家族转录调节因子、假设蛋白及重组酶与粪肠球菌（Enterococcus faecalis）及产布劳特氏菌（Blautia producta）同源性92–94%，xdh基因在排除艰难梭菌后仅与拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）三株菌株5′区75%一致，MGE整体与E. faecalis（IDRL-7538）及B. producta（ATCC 27340、DSM 2950）下游基因>94%一致且覆盖73%，推测该MGE可能源自这些肠道菌的水平转移，xdh可能二次插入MGE以提升适应性。
PRB1128 has a competitive advantage against a non-RT023 C. difficile in continuous flow mini-bioreactor arrays
研究人员在BRM3培养基中验证PRB1128在0.5%木糖醇下密度显著增加（P < 0.0005），?xdh无改善，CD2015（RT027）则下降（P < 0.05）。微型生物反应器阵列（MBRAs）竞争实验显示，有木糖醇时PRB1128在第3、6天显著优于CD2015（P < 0.0005, P < 0.005），无木糖醇时CD2015在第1、6天占优（P < 0.05）；?xdh与CD2015在无木糖醇时势均力敌，有木糖醇时第6天?xdh略占优（P < 0.05），表明xdh赋予RT023在木糖醇环境下的竞争适应性优势，但?xdh可能存在其他基因组特征耐受木糖醇。
PRB1128 can stably colonize an antibiotic-treated fecal community in minibioreactor arrays
研究人员建立克林霉素处理的体外人粪菌社区于MBRAs中，挑战接种PRB1128六天，发现在有无0.5%木糖醇下均能稳定定殖且水平相似。第6天16S rRNA测序显示木糖醇使菌群中肠杆菌科（Enterobacteriaceae）及Collinsella减少，梭菌科（Clostridiaceae）增加，拟杆菌属（Bacteroides）、布劳特氏菌属（Blautia）、Flavonifractor亦变化。表明xdh在体外赋予适应性优势，但粪菌社区定殖不依赖木糖醇，木糖醇重构社区可能使其他Clostridiaceae增殖限制PRB1128承载量。
讨论与结论总结
研究人员在讨论中指出，本研究揭示了分支3 RT023艰难梭菌菌株因MGE携带xdh基因而具备独特木糖醇利用表型，xdh缺失证实其为木糖醇利用必需，诱导回补恢复生长；xdh可能源自其他梭菌科，MGE其余部分可能单次转移至RT023，该HTH位点为跨分支插入热点。木糖醇利用在生物反应器中赋予对非RT023菌株的适应性优势；PRB1128在抗生素处理粪菌社区中有或无木糖醇均成功定殖。RT023菌株基因组>99.8%相同，表型具代表性。饮食木糖醇增加是否驱动病原体适应或毒力未知，畜禽饲料添加木糖醇提升耐热性可能选筛动物携带高毒力菌株。木糖醇改变菌群组成，可能通过交叉喂养（cross-feeding）或杀菌效应影响定殖，其他Clostridiaceae增殖可能限制RT023承载量；MGE可能因xdh重要性或调控功能维持，其能否切除传播未知。综上，研究描述了RT023菌株因MGE含xdh实现木糖醇利用的独特表型，并将其与体外适应性优势联系，探究木糖醇利用对RT023生理及毒素产生的影响有助于阐明其高毒力疾病机制。
翻译研究结论部分：
在本研究中，研究人员揭示了使分支3 RT023艰难梭菌（Clostridioides difficile）菌株区别于其他测试菌株的独特碳利用表型。RT023菌株能够利用木糖醇，这是由于移动遗传元件（Mobile Genetic Element, MGE）中存在木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase, xdh）基因。研究人员删除了xdh并确认其为木糖醇利用所必需。利用诱导型质粒回补恢复了含木糖醇培养基中的生长。xdh基因可能来源于其他梭菌科（Clostridiaceae），而转录调节因子、假设基因和重组酶很可能基于核苷酸同一性和覆盖率源于一次从产布劳特氏菌（B. producta）或粪肠球菌（E. faecalis）的转移事件。研究人员认为该位点是艰难梭菌各分支间基因组多样性的热点，因为在分支1和4的菌株中也观察到插入不同数量和内容的MGE基因。代谢木糖醇的能力在生物反应器中与非RT023菌株竞争时赋予了适应性优势。此外，一株能在高水平木糖醇中生长的RT023菌株（PRB1128）在有和无木糖醇存在下均能成功定殖于抗生素处理的粪菌社区，且水平相似。
