《Behavioural Brain Research》：LPS?induced impairment of neuroregeneration is alleviated by fluoxetine in Dugesia japonica
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Zuoqing Yuan|Jinying Huang|Qi Chen|Jingyi Sun|Rui Cao|Huidan Shi|Ran Li|Jianyong Zhang中国山东省淄博市沂源县土门镇附近溪流中采集的淡水涡虫，实验在山东理工大学生命科学与医学学院进行，邮编2550
Zuoqing Yuan|Jinying Huang|Qi Chen|Jingyi Sun|Rui Cao|Huidan Shi|Ran Li|Jianyong Zhang
中国山东省淄博市沂源县土门镇附近溪流中采集的淡水涡虫，实验在山东理工大学生命科学与医学学院进行，邮编255000
摘要
淡水涡虫（Dugesia japonica）因其依赖神经母细胞的再生能力，成为研究神经再生的理想模型。本研究探讨了氟西汀（FLX）在Dugesia japonica再生过程中对脂多糖（LPS）引发的神经炎症以及环孢素A（CsA）介导的线粒体自噬抑制的调节作用。实验中，涡虫分别或同时暴露于LPS、FLX和CsA中10天，随后检测其再生情况、运动能力、抗氧化功能、DNA损伤、神经母细胞增殖情况、细胞凋亡程度以及PINK1/Parkin信号通路活性。结果表明，10 μg/mL的LPS和0.5 μg/mL的CsA会显著损害涡虫的眼点再生能力和运动能力，干扰抗氧化酶（SOD、CAT、GST、GR）的活性与表达，引发DNA损伤，抑制神经母细胞增殖，扰乱与神经递质相关的基因表达，还会降低PINK1/Parkin通路中的关键蛋白LC3B的水平。2 μg/mL的FLX可通过恢复抗氧化平衡、减轻DNA损伤、促进神经母细胞增殖——可能与其激活PINK1/Parkin相关的线粒体自噬有关——以及使与神经递质合成相关的基因恢复正常，从而缓解上述不良影响。值得注意的是，CsA能够逆转FLX的神经保护作用，这说明FLX通过PINK1/Parkin相关的线粒体自噬通路发挥对LPS毒性的保护作用。本研究证实了FLX的神经保护潜力，进一步强调了D. japonica作为研究线粒体自噬相关神经再生的模型的价值，同时也为将FLX用于治疗线粒体自噬及神经再生功能障碍相关的神经系统疾病提供了初步依据。
引言
氟西汀（FLX）是首个获得临床批准的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，是全球使用最广泛的抗抑郁药之一[1]、[2]。它主要用于治疗重度抑郁症，也可用于强迫症、暴食症和肥胖症[3]、[4]。其治疗效果源于对5-羟色胺转运体的抑制，该作用可减少突触前5-羟色胺的再摄取，提高突触处的5-羟色胺浓度，进而调节情绪[5]。
除了抗抑郁作用外，FLX还具有神经保护、抗炎和抗肿瘤特性[6]、[7]、[8]。在神经科学研究中，它在多种脑损伤模型中都能发挥保护作用：通过抑制神经炎症和保护血脑屏障来减轻缺血性脑损伤[9]，通过维持血脑屏障功能和抑制小胶质细胞活性来缓解脊髓损伤[10]，还能在创伤性脑损伤后促进海马区的神经发生[11]、[12]。在蛛网膜下腔出血的情况下，FLX可通过抗炎、抗凋亡机制以及调节NF-κB信号通路来减轻早期脑损伤和神经炎症[13]、[14]，因此有望成为治疗脑缺血的候选药物。其相对较低的毒性也是其在临床应用中优于其他选择性5-羟色胺再摄取抑制剂的原因之一[15]。
越来越多的证据表明，FLX具有促进自噬的作用[16]。例如，Gassen等人[17]发现FLX能上调星形胶质细胞中的自噬标志物（Beclin-1、Atg12），而Gulbins等人[18]则发现FLX可通过细胞器脂质积累诱导海马区神经元发生自噬，这提示自噬功能的调控可能与FLX的抗抑郁作用存在关联[19]。自噬是一种在进化过程中一直存在的分解代谢过程，它能将受损的细胞成分包裹进自噬体，随后由溶酶体将其降解。线粒体自噬作为一种特殊类型的自噬，能够选择性地清除功能受损的线粒体，从而在应激状态下维持线粒体功能稳定，进而抑制神经元凋亡并减少氧化应激带来的损伤[20]、[21]。PINK1/Parkin信号通路是调控线粒体自噬的核心机制：积累在受损线粒体上的PINK1会进一步激活Parkin蛋白，后者会修饰线粒体蛋白并招募自噬相关机制来启动线粒体降解[22]。与自噬/线粒体自噬的神经保护作用一致，越来越多的证据表明FLX可通过调控自噬活性来保护神经元。例如，在蛛网膜下腔出血后，FLX可通过诱导自噬来减轻NLRP3炎性小体及caspase-1的活化，并通过调节鞘磷脂-神经酰胺的代谢来增强自噬通量，从而保护神经元[18]。
淡水涡虫（Dugesia japonica）因其依赖于多能神经母细胞的强大再生能力，成为研究神经再生的理想模型[23]。尽管已知FLX具有调控神经元可塑性和抑制神经炎症的作用，但它对涡虫神经再生的影响仍不明确，尤其是其促自噬特性与再生结果之间的关联。脂多糖（LPS）常被用于在涡虫体内诱发应激反应和免疫反应。先前的研究表明，LPS能够上调涡虫的免疫相关基因（DjRIG-I、DjGILT、DjTRAF2）[24]、[25]、[26]，说明LPS能触发涡虫的先天免疫反应——不过这种反应与哺乳动物中由TLR4介导的炎症信号传导有所不同[27]，因为目前尚未在Dugesia japonica中明确TLR4信号传导的机制。在本研究中，我们建立了LPS诱导应激的涡虫模型，并在再生过程中给予FLX处理。我们系统地检测了涡虫的抗氧化能力、细胞增殖情况、细胞凋亡程度、DNA损伤状况、再生进程以及PINK1/Parkin信号通路活性。这些系列检测旨在分别了解上游的氧化应激反应、中间的细胞行为变化以及下游的神经再生表型，核心目的是验证FLX是否通过线粒体自噬来挽救LPS诱导的神经再生障碍。这项研究为理解FLX的神经保护机制提供了依据，也为相关脊椎动物的神经保护研究提供了参考。
章节节选
实验动物与化学试剂
D. japonica是从山东省淄博市沂源县土门镇附近的溪流中采集的。经过2周的适应训练（温度22±1℃，12小时光照/黑暗周期，每周喂食两次新鲜河虾）后，我们挑选出体型一致且形态完好的涡虫用于实验。氟西汀（FLX，纯度≥98%）和环孢素A（CsA，纯度≥98%）购自上海麦克林生物技术有限公司。脂多糖（LPS）来自上海贝赛姆生物技术有限公司。其他试剂均为分析级产品。
FLX处理对涡虫头部再生及运动能力的影响
眼点再生是判断涡虫头部再生情况的关键指标，不同实验组的眼点再生过程存在明显的时间差异（见图2A、2B）。截肢后第5天时，对照组的眼点发育程度略高于LPS处理组、FLX处理组以及LPS+FLX联合处理组；不过这一差异并未达到统计学显著性（p > 0.05）。到第7天时，对照组和LPS+FLX联合处理组的涡虫已完成眼点再生
讨论
LPS是一种经典的神经炎症诱导因子[31]，本实验中它显著损害了涡虫的再生能力和运动能力。这一结果与先前的研究一致，即LPS诱导的神经炎症会破坏神经可塑性和干细胞功能[32]。具体而言，LPS处理组的眼点再生受到抑制，其运动能力也大幅下降，仅相当于对照组的18%，这进一步证实了LPS的神经毒性和再生毒性作用
结论
综上所述，氟西汀（FLX）能有效改善LPS在Dugesia japonica中引起的再生能力、运动功能受损问题，以及氧化应激、DNA损伤和神经功能障碍。从机制上看，FLX的这些保护作用可能与PINK1/Parkin相关的线粒体自噬通路有关，因为它能够维持神经母细胞的增殖，调节抗氧化酶（如SOD、GST）的活性，还能调控与多巴胺相关的神经元特异性基因的表达
资金支持
本研究得到了中国山东省自然科学基金的支持（项目编号：ZR2023MC112）。
作者贡献说明
Ran Li：正式分析，数据整理。Huidan Shi：正式分析，数据整理。Jianyong Zhang：论文撰写与修改，实验指导，项目管理，资金申请。Jinying Huang：方法设计，实验开展，正式分析，数据整理。Zuoqing Yuan：项目管理，资金申请，正式分析，数据整理，研究构思，实验开展，论文初稿撰写。Jingyi Sun：方法设计，实验开展，数据整理。Qi Chen：结果可视化处理
利益冲突声明
所有作者均声明不存在任何可能影响本研究结果的潜在利益冲突或个人关系。
