儿童脓毒症中氨诱导的细胞死亡相关关键基因的识别：机器学习、单细胞技术及虚拟基因敲除方法

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Key Genes Identified in Ammonia-Induced Cell Death During Pediatric Sepsis: Machine Learning, Single-Cell, and Virtual Gene Knockout Approaches

　　

黄永峰|李行传|蒋然

中国甘肃省兰州市兰州大学，邮编730030

摘要：

背景

脓毒症是一种由感染引发的免疫反应失调所导致的危及生命的器官功能障碍。氨诱导的细胞死亡是一种新型的细胞死亡方式，其与脓毒症的关联目前尚不清楚。本研究旨在识别儿科脓毒症中与氨诱导的细胞死亡相关的关键基因。

方法

从基因表达组数据库中获取儿科脓毒症的批量转录组数据和单细胞转录组数据。在批量转录组数据中筛选出差异表达基因以及加权基因共表达网络中的关键模块基因，再与氨诱导的细胞死亡相关基因取交集。运用多种机器学习算法构建诊断模型并确定关键基因。通过CIBERSORT分析免疫浸润情况。利用单细胞RNA测序分析关键基因的表达特征，并进行细胞间通讯分析。进一步通过scTenifoldKnk在虚拟基因敲除条件下进行功能富集分析。

结果

最优诊断模型共识别出9个与儿科脓毒症中的氨诱导的细胞死亡相关的关键基因，分别为STOM、SORT1、PADI4、MMP9、LCN2、CR1、TSPO、TXN和IL1RN。免疫浸润分析显示，脓毒症组中巨噬细胞M0和中性粒细胞的占比上升，而CD8阳性T细胞和初始B细胞的占比下降。单细胞分析表明，脓毒症组中的单核细胞中TSPO和TXN的表达水平升高。在虚拟敲除TSPO和TXN后，受影响的基因分别富集在B细胞受体信号通路和血小板活化通路中，同时共同富集在造血细胞谱系等通路中。

结论

本研究确定了包括TSPO和TXN在内的9个基因为儿科脓毒症中氨诱导的细胞死亡的关键基因。所构建的诊断模型具有潜在的临床应用价值。在儿科脓毒症的高氨环境中，单核细胞可能是发生氨诱导的细胞死亡的潜在细胞类型。TSPO和TXN可能通过不同机制影响儿科脓毒症中的氨诱导的细胞死亡过程。

引言

脓毒症是指机体对感染的反应失调所导致的危及生命的器官功能障碍。全球每年有超过4800万例脓毒症病例，由此导致的死亡人数高达1100万[1]。在所有年龄群体中，儿科患者的脓毒症相关死亡率最高。全球每年约有330万儿童死于脓毒症，其中很多是新生儿[1]。尽管重症监护技术不断进步，儿科脓毒症仍然是儿科重症监护室内的主要死因之一[2]，其复杂的病理生理机制至今仍未完全阐明。

脓毒症发作过程中会出现显著的代谢紊乱，而氨代谢异常是其重要的病理特征之一[3]。氨是氨基酸代谢的最终产物。在脓毒症状态下，肝功能受损、肠道菌群失调以及氨基酸代谢加速等多种因素共同作用，导致血液中氨含量升高；高浓度的氨具有细胞毒性[3]、[4]。有研究指出，患者入院时血液中的氨浓度越高，其预后越差[4]。近年来，由代谢失衡引发的细胞死亡机制得到了广泛研究[5]。氨诱导的细胞死亡是一种备受关注的新型细胞死亡方式，它是由线粒体内谷氨酰胺衍生的氨过量积累所引起的细胞死亡类型[6]。这种细胞死亡最初是在单核细胞利斯特菌感染模型中的CD8⁺效应T细胞中被发现的，其典型特征表现为溶酶体碱化、线粒体损伤以及自噬功能受损[6]。在脓毒症的免疫病理过程中，早期会出现过度炎症反应，后期则会出现免疫抑制；T细胞的快速增殖主要发生在抗原特异性激活之后，是适应性免疫反应的核心过程之一[7]。作为脓毒症免疫机制中的关键效应细胞，CD8⁺ T细胞的死亡和功能抑制与脓毒症引发的免疫抑制密切相关[8]。然而，氨诱导的细胞死亡与脓毒症之间的关联尚未得到系统阐述，还需要进一步研究来确定与氨诱导的细胞死亡相关的基因是否可以作为具有诊断或机制研究意义的生物标志物用于儿科脓毒症的检测。

本研究旨在通过整合生物信息学方法与多种机器学习算法，系统地识别出在儿科脓毒症中具有潜在诊断价值的氨诱导的细胞死亡关键基因。在此基础上，我们进一步通过免疫浸润分析评估了这些关键基因与免疫微环境特征之间的关联。此外，我们在单细胞层面深入分析了这些关键基因在特定免疫细胞亚群中的表达模式，随后进行了细胞间通讯分析，并通过虚拟基因敲除模拟来预测它们对潜在功能通路的影响。

章节节选

数据获取与预处理

我们使用GEOquery R软件包从基因表达组数据库中下载了儿科脓毒症的微阵列批量转录组数据集，包括GSE8121、GSE9692、GSE26378和GSE26440[9]。在数据预处理阶段，我们使用了dplyr R软件包对数据进行了筛选；借助limma R软件包中的normalizeBetweenArrays函数对数据进行了分位数标准化处理，同时还使用了avereps函数来处理样本数据中可能存在的重复条目[10]。对于这些数据集

研究技术路线（图1）

数据预处理与差异表达基因的识别

在数据预处理完成后，我们从训练组中筛选出了21,754个基因以便后续分析。通过对脓毒症组与对照组的数据进行差异分析，共识别出365个差异表达基因（见补充文件），其中包括293个表达上调的基因和72个表达下调的基因（见图2A、2B）。

通过加权基因共表达网络分析识别与脓毒症显著相关的模块

当软阈值β设定为15时，在1到20的范围里，无标度拓扑拟合指数R²的值大于0.85，且平均连通性保持稳定，这说明

讨论

由于氨诱导的细胞死亡最初是在效应CD8⁺ T细胞中被发现的[6]，目前的多数研究都集中在肿瘤相关疾病上，而关于它在传染病中的作用的研究相对较少。脓毒症状态下较高的氨浓度为氨诱导的细胞死亡提供了潜在的代谢基础[3]、[4]。通过批量转录组数据，本研究系统地确定了STOM、SORT1、PADI4、MMP9、LCN2、CR1、TSPO、TXN和IL1RN这九个基因与儿科脓毒症中的氨诱导的细胞死亡相关。

结论

本研究系统地确定了儿科脓毒症中氨诱导的细胞死亡的关键基因，包括TSPO、TXN、STOM、SORT1、PADI4、MMP9、LCN2、CR1和IL1RN，这些基因有望成为诊断儿科脓毒症的潜在生物标志物。同时，基于这些关键基因构建的诊断模型具有较好的预测性能，具备辅助临床决策的潜在应用价值。单细胞分析表明，单核细胞可能是发生氨诱导的细胞死亡的潜在细胞类型。

CRediT作者贡献声明

李行传：指导、项目管理、研究、正式分析。黄永峰：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、软件使用、资源获取、项目管理、方法学、研究、正式分析、数据整理、概念构思。蒋然：写作——审阅与编辑

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。