综述：面向CO2固定途径优化的系统生物学方法

《Current Opinion in Biotechnology》：Systems approaches for optimizing CO2 fixation pathways

　　

研究人员综述了近期关于CO2固定途径设计与构建的相关研究，指出当前存在设计完善的代谢途径与实际高产工程菌株之间的性能差距，该差距包含设计阶段常被忽略的隐藏酶能量消耗、适应性进化过程中的调控网络重构等系统水平现象。多种系统生物学工具可有效弥合这一差距：基于新算法可快速构建动力学模型，其与逆向生物合成技术联用可在宿主固有代谢网络背景下评估途径的动态特性与稳定性；定量与互作蛋白质组学可揭示宿主菌株对新引入途径的适应性响应，识别内源代谢物对异源途径的干扰作用；以适应性实验室进化（ALE）为代表的体内优化策略已广泛应用于模块或全途径的优化，但其前提是途径表型需与生长表型建立关联；进化后表征结果显示，细胞可通过显著的蛋白质组资源重分配实现途径与宿主的代谢整合。

Introduction

系统生物学方法将碳固定途径置于细胞环境背景下开展研究。传统途径设计多基于化学计量学分析，例如设计算法利用实测或估算的酶动力学常数比较达到特定通量所需的总蛋白量，同时考量蛋白表达对细胞的资源负担，此外还将化学计量学层面的能量与还原力消耗、潜在的体内热力学驱动力作为筛选指标。然而近期研究揭示了热力学有利的途径设计与反应器水平实现CO₂固定的微生物菌株之间存在显著差距，该差距包含宿主能量状态、代谢组状态、与宿主代谢物的交叉对话、适应性进化过程中的调控重构等系统水平现象。现有综述已分别涵盖碳固定途径的酶学机制、能量学特征、与化学合成的整合、宿主选择与合成生物学考量等维度，本综述重点阐述微生物碳固定的“设计-构建-进化-学习”实施循环，以及各阶段可应用的系统生物学工具。

Designing pathways in a cellular context

途径设计正从单纯的化学计量学分析转向考量细胞实际资源投入。针对替代光呼吸途径的调研提供了典型框架：光呼吸是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）加氧产物2-磷酸乙醇酸（2-PG）的代谢耗散途径，合成替代途径可将2-PG转化为可利用的中心碳代谢物，同时降低能量消耗与碳损失。基于全基因组尺度拟南芥模型开展的 stoichiometric 分析，确保了途径筛选兼顾宿主ATP与NADPH平衡，同时纳入了可解释表型增益的新视角——例如叶绿体（邻近Rubisco）而非过氧化物酶体内的CO₂释放可带来生长优势。光合系统碳固定的另一常被预测模型忽略的维度是卡尔文循环的氧化还原调控：果糖-1,6-二磷酸酶/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶（F/SBPase）、磷酸核酮糖激酶（Prk）等酶的活性与还原状态相关，后者受光照调控。近期研究测定了植物中特定酶的还原动力学，并量化了蓝细菌裂解物中数百个半胱氨酸残基的氧化还原电位，发现光照后部分酶的还原速率较慢，这类瓶颈可作为蛋白质工程靶点，用于加速波动光强下的酶激活或提高稳态下活性酶的比例。即使设计完善的途径在体内也可能未被有效利用：利用定量蛋白质组学与资源平衡分析（RBA）对以甲酸为碳源的贪铜菌（C. necator）的研究显示，低生长速率下卡尔文循环酶呈组成型过量表达且未被充分利用，这类无用蛋白会占用生长相关过程的资源；将途径整合到经实验约束的RBA模型中，可更精准地评估维持高生长速率时可用的蛋白质组空间。

Lessons from new-to-nature pathways

Hidden energy costs revealed by tartronyl-CoA pathway

人工CO₂固定途径的核心特征是对天然酶进行改造以接受非天然底物，这类酶的早期迭代版本活性通常较低，需经定向进化提升活性。以丙二酰-CoA途径中的乙醇酰-CoA羧化酶为例，该酶利用ATP驱动碳固定，是酒石酰-CoA（TaCo）途径的组成部分。早期迭代版本不仅活性较低，且实测ATP消耗为每固定1分子CO₂消耗8分子ATP，远高于化学计量学预测的1分子ATP。随着酶性能的提升，这种无效ATP消耗被显著降低，该案例提示需对利用ATP的工程酶开展全面的能量消耗表征。

The output of a cycle matters

碳固定途径的设计通常以特定净产物为目标，例如还原型戊糖磷酸途径（rPP，即卡尔文循环）的甘油醛-3-磷酸。近期研究揭示了苹果酰-CoA-甘油酸（McG）循环产物乙酰-CoA的多效性效应：McG循环以磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）或乙醇酸为底物，可补充卡尔文循环功能；当以乙醇酸为底物时，该循环不实现净CO₂固定，但产物乙酰-CoA是脂质与甲羟戊酸途径的前体。在植物中表达该循环后，生长增益显著高于化学计量学预测，鲜重与干重提升至2-3倍，推测与乙酰-CoA对植物生长的促进作用相关，这类多效性效应是当前模型难以预测的。此外，从碳固定循环中调取中间产物可能导致中间物耗竭，近期研究展示了如何设计回补循环以补充CETCH循环耗竭的中间产物，为提升人工碳固定循环的灵活性提供了可行策略。

Overcoming thermodynamic infeasibility in CO₂ fixation: the case of reduction to formate

部分CO₂固定途径同化甲酸，而CO₂还原为甲酸的反应在热力学上通常不利。近期研究实现了体内CO₂向甲酸的转化：电活性细菌Shewanella可接受阴极电子，利用内源性甲酸脱氢酶将CO₂还原为甲酸，导入还原型甘氨酸途径（rGlyP）后可实现电极自养生长。在P. putida中，通过提高进气CO₂浓度与胞内NADH/NAD⁺比值可实现CO₂还原；进化获得的rGlyP依赖型生长菌株携带NADH氧化酶截短突变，导致NADH水平升高，促进了体内甲酸脱氢酶的CO₂还原反应。类似地，含有卡尔文循环的E. coli在适应性进化过程中也出现了提升NADH水平的突变。CORE循环为克服甲酸还原的能量壁垒提供了新思路：该循环中CO₂在ATP驱动下固定到受体分子，随后经NADPH还原，分步释放甲酸，整体可利用ATP与NADPH在有氧条件下甚至从环境水平CO₂中生产甲酸。

Systems tools: what is the immediate future in pathway design?

Advancing pathway modeling

碳固定与同化循环的集成动力学建模是预测途径稳定性的有效工具。例如鲁棒性分析指导E. coli在导入RuMP循环前敲除磷酸果糖激酶（Pfk）等分流酶，可加速后续菌株的适应性实验室进化（ALE）；稳定性分析也可解释E. coli进化获得卡尔文循环利用能力过程中出现的突变——进化菌株中磷酸葡萄糖异构酶（Pgi）活性下调，减少了循环中间产物的外漏。相较于广泛使用的化学计量学模型，动力学模型可模拟扰动后的稳定性、识别通量控制系数、更准确评估热力学驱动力。尽管动力学模型的参数化是主要瓶颈，但RENAISSANCE等机器学习工具已加速了这一过程，结合可整合海量反应数据库与基因组尺度模型的逆向生物合成算法，未来有望在宿主代谢完全整合的背景下全面枚举与筛选具有稳定性的替代途径。此外，细胞代谢物对途径的交叉调控不容忽视，近期研究利用有限蛋白酶解小分子 mapping（LiP-SMAP）技术检测了蓝细菌与石生自养细菌卡尔文循环中酶与非底物代谢物的互作，发现F/SBPase受到广泛的抑制与激活调控。

Selector strains enhance individual enzyme steps by linking them to growth

筛选单个酶的核心工具是筛选菌株（selector strain），其原理是将靶酶活性与易检测的表型（如生长或信号分子产生）偶联，这对高通量筛选或选择改良酶变体至关重要。早期利用筛选菌株优化Rubisco的研究构建了异源Rubisco变体活性依赖型E. coli生长体系；结合条形码技术与深度测序追踪变体丰度，筛选菌株可解析序列-适应度景观，近期针对Rubisco的研究显示，含有II型Rubisco的筛选菌株（包括蓝细菌与E. coli）倾向于富集加氧速率降低而非羧化速率提升的变体。针对全合成碳固定途径的可靠体内筛选需要设计将所有途径中间产物与宿主代谢网络隔离的筛选菌株，确保生长完全依赖整个途径的功能；也可利用筛选菌株在组装全途径前优化部分模块，近期以乙醇酸筛选菌株为基准的计算与实验工具已得到显著拓展。

Adaptive laboratory evolution and host integration

体外优化途径通量需要遍历酶丰度与途径输出的组合，工作量极大，机器学习引导的实验试验系统改进框架（METIS）可减少实验量并辅助数据解读。而在体内应用中，途径嵌入细胞环境，通常采用ALE实现“体内脱瓶颈”——该方法可探索更大的序列空间，但表型输出通常为细胞生长（假定与途径产物相关），且不仅需要优化途径本身，还需优化容纳途径的细胞网络。例如进化获得卡尔文循环利用能力的E. coli仅需3处宿主网络遗传改变：包括减少中间产物外漏的Pgi突变，以及RNA聚合酶亚基与全局分解代谢调节因子Crp的突变，后者显著改变了超过20个基因的表达，说明调控基因的突变可通过紧凑的突变集实现目标表型。以甲醇为碳源的E. coli ALE实验中，DNA聚合酶III突变产生了高突变背景，250代后20%的检测蛋白丰度发生改变。近期针对需碳固定的合成途径ALE研究揭示了反直觉的适应策略：采用rGlyP的贪铜菌（C. necator）在ALE后途径酶表达量从占总蛋白质组的8%降至不足1%，释放的资源用于核糖体合成以提升生长速率；进化获得甲醇同化能力的E. coli在高生长速率下利用甲醇产生的高NADH分泌乙酸，后期通过上调乙酸氧化回收利用。多个甲醇同化工程菌株的ALE案例显示，细胞会进化出清除有毒中间产物甲醛的机制：含有RuMP途径的酵母在甲醇进化中上调内源性丝氨酸途径同化甲醛，实现两条C1同化途径并行运行；E. coli甲醇进化中出现了转录-复制冲突，该冲突随进化进程逐渐缓解；E. coli还会响应甲醛导致的细胞死亡释放的蛋白碎片，提升二肽透酶操纵子（ddp）的拷贝数，该元件后续被用于实现甲醇同化基因的动态拷贝数调控。ALE的实验模式需谨慎选择，分批培养可能筛选出适应生长后期条件（如高pH）的菌株，而连续培养与分批培养的ALE结果基因型差异显著；未来多特征筛选技术可实现除生长外的途径输出直接测量，例如近期开发的卡尔文循环产物3-磷酸甘油酸体内生物传感器，已用于基于羧化速率的Rubisco排序。

Putting a pathway in its place by compartmentalization

区室化长期被视为共定位途径以提升活性的潜在策略。对羧酶体等蛋白质微区内气体传输机制的认知已取得进展：α-羧酶体可封装多种异源酶并能在植物中表达，其对氧气的低通透性可提升封装氢化酶的活性，这一特征对含有氧敏感CO₂固定酶的途径具有重要意义。其他细菌微区室也在探索中，近期研究显示封装蛋白（encapsulin）可包裹多种形式的Rubisco并保持活性；未来工程方向包括提升这类合成区室的多酶结合能力，以及调控其对其他底物的通透性。

Conclusions

迄今为止，CO₂固定途径的优化主要集中在途径本身的改良，当前领域已进入“设计-构建-进化-学习”循环，系统生物学方法可贯穿各环节：包括组装前的动力学与热力学分析以识别不稳定性、高通量筛选内源代谢物的交叉反应性、设计用于体内优化的筛选菌株、以及适应性实验室进化后的多组学分析以解析宿主代谢网络的调整机制。研究发现细胞对途径的优化策略常与设计预期不同，包括蛋白质组的重分配。未来体内循环产物的直接读取、ALE模式的革新将进一步加速途径工程研发，摆脱仅以细胞生长为单一表型输出的局限。