大麻素合酶CBCAS、CBDAS与THCAS的X射线晶体结构

《Current Research in Structural Biology》：X-ray crystal structures of the cannabinoid synthases CBCAS, CBDAS and THCAS

　　

大麻素合酶（CSase）家族包含大麻环萜酸合酶（CBCAS）、大麻二酚酸合酶（CBDAS）和四氢大麻酚酸合酶（THCAS），这三种酶是负责从共同前体大麻萜酚酸（CBGA）生物合成各自对应代谢物的主要大麻素合酶。作为催化生成具有重大制药价值生物分子的催化剂，这些酶在异源生产、催化机制阐释以及整合至合成生物学途径以实现工业上简便生产这些分子等方面引起了广泛关注。这些酶具有高度的同源性，因此它们截然不同的底物特异性由序列及结构上非常微小的差异所控制，尽管迄今为止仅报道过THCAS的结构。在本报告中，研究人员展示了CBCAS与CBDAS的结构，以及分辨率高于已知结构的THCAS结构，且それぞれ均与其黄素辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）形成复合物。这些结构揭示了可能导致所观察到的互补催化活性的活性位点差异，不仅体现在第一壳层氨基酸的取代上，还体现在通过变构效应影响活性位点拓扑结构的较远残基，或对底物进入产生影响的残基上。这些结构为合理工程化改造这些酶以改善或改变其化学选择性提供了一个有用且信息丰富的平台。

大麻素是一类具有广谱生物活性的植物源化合物。在大麻中，主要的大麻素化合物大麻环萜（CBC）、大麻二酚（CBD）和Δ⁹-四氢大麻酚（THC）均由共同前体大麻萜酚酸（CBGA）在 predominantly 三种大麻素合酶（CSase）的催化下分别合成为其羧酸形式。由于这些分子在治疗多种疑难病症方面具有显著的临床潜力，学术界与工业界对其异源表达和合成生物学应用产生了浓厚兴趣。然而，这些合酶在序列上高度同源，却在催化CBGA时表现出不完全的化学选择性，例如CBDAS在合成大麻二酚酸（CBDA）时会产生作为受控物质的THC。为解决选择性控制问题，研究人员曾基于AlphaFold模型进行过初步的工程化改造，但缺乏实验测定的三维结构极大地限制了机制的深入理解。在2012年，仅有一项THCAS结构被解析（PDB代码：3VTE，分辨率2.75 ?），而CBCAS与CBDAS的结构一直未知。因此，获取这三种酶的高分辨率晶体结构对于揭示其底物选择性的结构基础及指导后续的蛋白工程化改造具有重要意义。

这项研究由Jack Domenech等人开展并发表在《Current Research in Structural Biology》上。研究结论成功解析了三种大麻素合酶的高分辨率三维结构，揭示了决定其不同催化特异性的活性位点结构特征，为酶的定向改造和工业合成应用提供了关键的结构生物学平台。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用了X射线晶体学方法来解析蛋白质结构。具体而言，研究团队将人工合成并经过密码子优化的目的基因克隆至表达载体中，将其转化至Komagataella phaffii（X-33菌株）中进行重组蛋白的异源表达。随后，通过规模化的发酵培养获取分泌表达的目的蛋白，并依次利用镍亲和层析、阳离子交换层析和尺寸排阻层析等技术对蛋白进行纯化。为了消除糖基化对结晶过程的干扰，研究人员使用Endo H或Endo F1对纯化后的蛋白进行了去糖基化处理。最后，研究人员通过 sitting drop 法筛选并优化结晶条件，获取了高质量的蛋白质单晶，并在同步辐射光源下完成X射线衍射数据的收集与结构解析。

在“克隆、表达与纯化”部分，研究人员通过研究发现，使用添加了PTM1盐的丰富培养基进行高细胞密度补料分批发酵，能够获得达到结晶级纯度的CSase酶。经过一系列色谱纯化和去糖基化处理后，研究人员成功获取了适用于后续结晶实验的高质量重组蛋白样品。

在“CSase的整体结构”部分，研究人员分别获得了去糖基化后的CBCAS、CBDAS与THCAS的晶体并解析了其结构。结果显示，CBCAS结晶于空间群P4₂1₂中，分辨率为2.43 ?；CBDAS结晶于空间群P2₂2₁中，分辨率为1.70 ?；THCAS结晶于空间群P2₁2₁2₁中，分辨率达2.33 ?，整体结构得到了更高的分辨率。三种酶均包含FAD结合结构域和底物结合结构域，且结构均证实了辅酶FAD与蛋白质侧链H114和C176之间的双共价连接。尽管研究人员进行了共结晶和浸泡实验，但未能在任何晶体结构中成功解析出CBGA底物的电子密度。

在“CBCAS、CBDAS与THCAS的活性位点”部分，研究人员通过结构比对分析得出了决定催化特异性的关键结论。研究指出，尽管全局折叠相似，但三种酶的活性位点在残基构象上存在显著差异。例如，在CBDAS中，W443残基显著向黄素下方的底物结合口袋旋转，这种位移主要归因于带有P192的该段环状结构具有较大刚性，使得Y190发生位移并挤占了W443原本的空间。此外，CBDAS中的A414被较小的丙氨酸取代，以及I445与旋转后的W443形成的疏水相互作用，共同改变了CBDAS活性位点的拓扑结构。较远区域的残基取代（如M289/T290与I293/R294）则通过影响底物进入通道的特性，进而对这些酶的化学选择性产生影响。

结论部分指出，若能为合成最重要的大麻素类化合物设计出具有更高选择性的生物催化剂，天然与非天然大麻素的生物技术制备将具有巨大潜力。通过合理工程化改造大麻素合酶以提升其选择性，将得益于更加完善的包括异源表达方案、突变研究、分子建模在内的综合性实验方案，以及能够提供活性位点结构细微差异的结构生物学信息。尽管研究人员未能成功测定这些合酶与CBGA底物结合的复合物结构，但当前展示的FAD复合物结构仍会为后续旨在改变并优化这些酶以用于实际工艺应用的研究奠定坚实基础。