AKNA通过改变干性因子的染色质结构以及促使这些因子滞留于细胞质中，从而驱动神经母细胞瘤细胞的命运转换

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：AKNA drives neuroblastoma cell fate transition through chromatin modifications of stemness factors and differentiation by cytosolic retention

　　

Soumen Manna|R. Kirtana|Tirthankar Baral|Jagdish Mishra|Piyasa Nandi|Subhajit Chakraborty|Niharika Mahto|Ankan Roy|Prahallad Mishra|Bhagyashree Pradhan|Pujarini Dash|Samir Kumar Patra

印度奥里萨邦鲁尔克拉国家技术学院生命科学系生物化学与分子生物学组表观遗传学与癌症研究实验室，邮编769008

摘要

神经母细胞在成体神经发生中起着关键作用。然而，其获得多能性或分化过程的详细机制尚不清楚。本研究通过基因敲低、免疫荧光、染色质免疫沉淀、AKNA定位、信号相互作用以及转录活性分析，阐明了AT钩蛋白AKNA在调节神经母细胞瘤细胞的多能性和干性中的作用。在多能性诱导过程中，AKNA主要存在于细胞核中；而在分化过程中，则通过FAK信号作用保留在细胞质中。AKNA的缺失会破坏神经母细胞瘤细胞的干性和分化潜能。在细胞核中，AKNA与KDM6B的共定位和物理结合可促进H3K27me3去甲基化，进而使H3K27ac沉积在干性基因的启动子上，从而触发这些基因的转录。这些发现表明AKNA是与表观遗传修饰因子及信号通路相关的神经母细胞命运决定因子的关键调节因子，为神经母细胞瘤治疗以及神经退行性疾病的再生医学提供了潜在靶点。

引言

含AT钩结构的蛋白质是一类具有小型AT结构域的蛋白质，该结构域足以与DNA小沟结合，在从植物到动物的各类生物中发挥着调控染色质重塑和基因表达的重要作用[1]、[2]。其中一种名为AKNA的蛋白质因其在免疫系统调控和发育中的作用而备受关注。早期研究显示，它在二次免疫反应中是CD40和CD40L启动子上的核定位转录因子[3]、[4]、[5]。后来研究发现，AKNA是一种中心体蛋白，可通过调控微管结构来调节神经发生，同时还能调控大脑室下区神经干细胞的上皮-间充质转化过程[6]。转录调控蛋白在细胞核与细胞质之间相互转移是一种普遍现象，以此实现多种功能。例如，螺旋-环-螺旋结构的差异分化抑制剂1是一种具有干性特征的基因，能够促进细胞的存活和增殖。在SH-SY5Y细胞中，用视黄酸处理后，ID1会被重新定位到细胞质中[7]。染色质修饰因子、转录因子以及DNA结构修饰蛋白之间的协同作用共同调控基因表达。在染色质修饰因子中，组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶是一些重要的酶类，它们与其他转录因子的相互作用尤为突出[8]。

转录因子决定细胞命运的能力依赖于其通过招募特定的表观遗传修饰因子来对目标位点的染色质进行重塑。许多含AT钩结构的蛋白质本身就具有染色质重塑功能，如ALL1、SWI/SNF、TAFII250、Ash1等[2]、[9]、[10]、[11]、[12]。在多能干细胞自我更新和分化过程中，表观遗传调控通过塑造独特的表观遗传特征来维持细胞的身份特性。在胚胎干细胞中，抑制性组蛋白H3K27三甲基化和激活性组蛋白H3K4三甲基化这两种标记会出现在特定谱系基因上，使得这些基因在命运转变时能够被精确地激活或抑制。研究表明，H3K4me3的沉积通常先于H3K27me3的去除，这样在H3K27me3被KDM6家族的去甲基化酶去除之前，基因就已处于可被激活的状态[13]、[14]。时间控制非常重要：即便存在H3K27me3，H3K4me3仍可沉积在启动子上，从而形成一种处于准备状态的染色质构型。当H3K27me3被去甲基化后，这种双重状态就会被解除，进而允许转录延伸[15]、[16]。目前的研究表明，与KDM6A相比，KDM6B在脑细胞中的作用更为重要，它对神经元发育、突触可塑性以及认知功能至关重要，其功能异常与认知障碍有关。相比之下，KDM6A在脑功能中的作用则相对不那么显著[17]、[18]、[19]、[20]。H3K27me3与CD133、NESTIN、CD44和SOX2等基因表达的抑制有关，而这些基因都是重要的干性和多能性相关因子。已知KDM6B在多种癌细胞中可通过表观遗传方式激活CD44和SOX2基因的启动子，并且在不同环境下能够维持造血干细胞的多能性[23]，同时也有研究指出它在小鼠齿状回神经元干细胞的维持和形成过程中起着重要作用[25]。另有研究显示，KDM6B会通过与T-Box转录因子、Smad蛋白、雌激素受体以及KLF4等多种DNA结合蛋白相互作用，被招募到转录起始位点[26]、[27]、[28]、[29]。另一种著名的转录因子p53也被认为可以通过招募H3K27去甲基化酶KDM6B到目标基因启动子上，从而在RA诱导的分化过程中决定细胞谱系[30]、[31]。此外，p53还会与HMG1、p300和TAFII250等AT钩结构蛋白相互作用，共同参与多种细胞功能及核定位过程[32]、[33]、[34]、[35]，或许也在AKNA的功能中发挥辅助作用。依赖Nodal信号的发育重编程过程依赖于H3K27me3的去甲基化，这一过程是由smad2/3介导的KDM6B被招募到目标基因启动子上来实现的[36]。还有其他研究也表明，KDM6B要么积累在细胞核中，要么被各种核内蛋白招募到启动子位置[37]、[38]。

根据现有文献，目前的观点是不同的转录因子和核内蛋白会协助像KDM6B这样的表观遗传修饰因子定位并发挥作用，进而重塑基因表达模式，从而决定细胞的命运。至于AKNA的中心体功能以及其在转录调控中的作用，目前了解还比较有限。进一步研究AKNA如何同时具备这两种功能，有望为理解细胞分化、免疫反应以及肿瘤发生机制提供新的见解。本研究探讨了AKNA作为上下文依赖性的染色质功能调节因子的作用机制，包括在不同条件下AKNA是保留在细胞质中，以及为何它对细胞的干性和分化过程都不可或缺。本研究还阐述了AKNA在组蛋白修饰中的分子机制，而这些机制对于激活与神经母细胞瘤谱系决定相关的基因至关重要。

章节节选

神经母细胞瘤细胞系的培养

IMR32和SH-SY5Y细胞系是从印度浦那的NCCS获得的。这些细胞系分别在DMEM培养基和F12培养基中培养。在培养基中加入10%的血清（Gibco，编号?10,270,106）以及1倍的抗生素和抗真菌药物，然后将培养物置于37℃、5%二氧化碳条件的培养箱中培养。为了诱导细胞的干性特性，培养这些细胞系时会使用DMEM/F12（1:1）混合培养基而非原有的培养基。在用不同化学物质处理细胞时，需要先统计细胞数量，再根据细胞的生长速率确定接种量

OAC1可诱导神经母细胞瘤细胞的多能性和干性

在IMR32和SH-SY5Y两种神经母细胞瘤细胞系中，用重编程剂OAC1进行剂量依赖性处理后发现，5μM浓度的OAC1就能显著上调所有检测到的干性和多能性标志基因的表达水平（见补充图S1）。而浓度高于30μM时则会引发显著的细胞死亡现象（具体数据未给出）。用5μM浓度的OAC1处理细胞后，细胞的集落形成能力以及神经球生成能力都会显著提升，生成的神经球数量更多，体积也更大（见图1A-C）。

讨论

本研究表明，AKNA在神经母细胞模型中以上下文依赖的方式，作为决定神经元谱系命运的关键调节因子发挥作用。能够诱导多能性的OAC1处理后，可使IMR32和SH-SY5Y细胞转化为具有更强自我更新和增殖能力的多能干细胞样细胞。与此同时，OAC1还能抑制细胞分化，这一现象可从TUBB3这种典型的分化标志基因表达水平的下降中体现出来[55]。从分子层面来看

CRediT作者贡献说明

Soumen Manna：负责原始稿撰写、软件应用、方法设计、实验实施、数据分析以及数据整理工作。R. Kirtana：负责结果验证、资源获取以及数据整理工作。Tirthankar Baral：负责结果可视化、结果验证以及实验研究工作。Jagdish Mishra：负责结果可视化、结果验证以及方法设计工作。Piyasa Nandi：负责结果可视化、方法设计以及数据分析工作。Subhajit Chakraborty：负责结果可视化、结果验证以及数据分析工作。Niharika Mahto：负责结果可视化、结果验证以及资源获取工作。Ankan Roy：负责软件应用、资源获取以及数据分析工作

资金支持

本研究部分得到了印度医学研究委员会（ICMR，印度）的资助，项目编号为IIRP-2023-2134，资助对象为SKP。

利益冲突声明

所有作者均声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

S. Manna和A. Roy感谢NIT-Rourkela提供的研究所研究计划项目资助。R. Kirtana获得了印度政府CSIR的奖学金支持。Niharika曾作为SERB项目（项目编号：EMR/2016/007034）的JRF/SRF研究员，之后又获得了NIT Rourkela研究所研究计划的奖学金支持。P. Dash博士是ICMR项目（项目编号：IIRP-2023-2134）的研究科学家。T. Baral、J. Mishra、S. Chakraborty、P. Nandi和P. Mishra也