基于LAMP平台与银离子适配体探针结合的无标记无洗涤电化学核酸检测方法

《Biosensors and Bioelectronics》：Label- and Wash-Free Electrochemical Nucleic Acid Detection via a LAMP Platform Coupled with Silver Ion Aptamer Probes

　　

Sangmo Lee|Soobin Lee|Yong Ju|Hyoyong Kim|Duck Cho|Ki-Ho Hong|Dongeun Yong|Hyun Gyu Park

韩国科学技术院化学与生物分子工程系（BK21 Four），大田市34141，韩国

摘要

我们提出了一种基于环介导等温扩增技术并结合银离子适配体探针的新型电化学核酸检测策略。该策略采用特殊设计的发夹形探针，其茎区包含能与银离子结合的适配体序列，环区则含有与目标序列互补的序列。在目标核酸存在的情况下，LAMP反应启动，生成的扩增产物会与探针的环区发生杂交。这种相互作用会破坏发夹结构，从而使银离子从茎区释放出来。释放出的银离子随后在电极表面参与氧化还原反应，产生与LAMP扩增产物数量成正比的电化学信号。利用这一方法，我们能够在45分钟内，从50微升的反应体系中检测出耐万古霉素肠球菌的vanA基因，检测限为10个拷贝，同时还能保持高度的特异性。由于该策略无需标记物、无需洗涤且只需一步操作，因此有望成为即时检测场景中实用的电化学分子诊断平台。

引言

近年来，即时检测分子诊断技术因能够实现快速、分散式的检测而备受关注，尤其在资源有限的地区，它有助于早期发现并实时监测病原体（Gavina等人，2023；Liu等人，2020；Vandenberg等人，2021；Wilner等人，2023）。在各类分子诊断技术中，实时聚合酶链反应因其高灵敏度和特异性而被视为金标准，能够确保可靠的检测结果（Heid等人，1996；Higuchi等人，1992；VanGuilder等人，2008；Wilhelm和Pingoud，2003）。然而，实时PCR耗时较长，且需要庞大昂贵的设备来进行精确的热循环和荧光读数，这限制了它在集中式医院或实验室中的应用（Garzarelli等人，2022；Kim等人，2025；Wilner等人，2023）。这些局限性促使人们开发出适用于即时检测应用的分子诊断系统。

为了替代传统PCR，便于在即时检测环境中进行核酸扩增，等温扩增技术得到了广泛研究。这类技术能够在无需热循环设备的恒定温度条件下实现核酸扩增（Compton，1991；Ju等人，2021；Jung等人，2010；Lee等人，2020；Lizardi等人，1998；Notomi等人，2000；Piepenburg等人，2006；Song等人，2020；Van Ness等人，2003）。其中，环介导等温扩增技术因可通过多种引物的协同作用实现快速高效的靶标扩增，且在含有扩增抑制剂的复杂生物样本中仍能保持良好性能，因而被广泛用于即时检测领域（Francois等人，2011；Jevtu?evskaja等人，2017；Kaneko等人，2007；Nwe等人，2024；Yamazaki等人，2011；Yang等人，2014）。基于这些优势，许多研究利用LAMP技术开发出了适用于即时检测的简易检测系统（Bartosik等人，2018；Izadi等人，2021；Martin等人，2016；Moranova等人，2022；Safavieh等人，2014）。

与此同时，电化学检测技术因其简单、便携且成本低廉的特点，已成为资源有限环境中的重要分析工具（Drummond等人，2003；Hammond等人，2016；Ronkainen等人，2010；Won等人，2011）。当与LAMP等等温核酸扩增技术结合使用时，电化学检测技术在构建简易的即时检测平台方面展现出巨大潜力（Bartosik等人，2018；Defever等人，2011；Hsieh等人，2012；Liu等人，2020；Moranova等人，2022；Patterson Adriana等人，2013）。早期基于LAMP的电化学核酸检测策略多使用可嵌入双链DNA的氧化还原分子，如亚甲蓝或锇化合物（Defever等人，2011；Hsieh等人，2012）。这类分子会嵌入扩增反应产生的双链DNA中，从而导致电极表面的电化学信号减弱。尽管这些方法能够实现对LAMP扩增产物的实时分析，但无法避免因LAMP中多种引物之间的非特异性扩增而导致的假阳性结果（Becherer等人，2020；Hardinge和Murray，2019；Kim等人，2023；Rolando等人，2020；Schneider等人，2019）。另一种代表性的策略是使用带有氧化还原分子标签的探针，这类探针可与目标核酸序列发生杂交，从而实现序列特异性的电化学检测（Bartosik等人，2018；Liu等人，2020；Moranova等人，2022；Patterson Adriana等人，2013）。虽然这些方法能够实现序列特异性检测，但通常需要复杂的固定化步骤、磁分离或洗涤流程，这限制了它们在即时检测场景中的应用。因此，仍需一种更为简化的电化学方法，能够在无需使用带氧化还原分子标签的探针的情况下，实现LAMP产物的高度序列特异性检测。

为了解决这一问题，我们开发了一种基于LAMP的新型电化学核酸检测方法，该方法使用银离子适配体探针，被称为LAMP-SAP。本研究中使用的银离子适配体基于含有C/C错配的双链DNA结构，这些错配处的胞嘧啶碱基的N3位点可以与银离子特异性结合，形成C-Ag⁺ -C金属介导的碱基对，从而增强双链结构的热稳定性，并有助于捕获银离子（Funai等人，2020；Ono等人，2008；Park等人，2012；Park和Park，2014；Torigoe等人，2012；Zhang等人，2017）。由于银离子具有氧化还原活性，包括我们的团队在内的多个研究小组都广泛将含C/C错配的序列应用于电化学传感技术中（Ebrahimi等人，2015；Kim，2019；Yakoh等人，2025；Yoon等人，2022）。基于这一理念，我们所开发的策略利用独特设计的发夹形探针，在目标核酸存在时促使银离子释放，这类探针的茎区含有银离子结合适配体序列，环区则含有与目标序列互补的序列。基于这一设计原则，我们成功检测出了耐万古霉素肠球菌的vanA基因。耐万古霉素肠球菌是重要的抗生素耐药菌株之一，其在即时检测环境中的早期识别对于防止院内感染和及时采取抗生素干预措施具有重要意义（Austin等人，1999；Faron Matthew等人，2016；Hierholzer等人，1995；Muto等人，2003；Ray等人，2002；Tacconelli和Cataldo，2008）。

章节节选

材料

本研究中使用的银离子结合适配体序列基于能够形成C-Ag⁺ -C金属介导碱基对的含C/C错配的双链DNA结构，这一结构最初由Ono等人（2008）报道，后来我们又根据之前研究中的序列进行了优化（Kim，2019）。本研究使用的所有DNA寡核苷酸均由韩国大田市的Bioneer?公司合成。银离子适配体探针的序列如下：fSAP，5′-CTC TCT CTT CCC TTC AAA TAT GAA ATC AAC CAT GTT GAT GTT CAA

基于LAMP的电化学核酸检测与银离子适配体探针结合的整体原理（LAMP-SAP）

如图1所示，LAMP-SAP依赖于发夹形的银离子适配体探针，这类探针只有在目标核酸存在时才会释放银离子。这些经过特殊设计的适配体探针的茎区含有银离子结合适配体序列，环区则与LAMP扩增产物的正向或反向环区序列互补。正如先前的研究所表明的，银离子对C/C错配序列具有很高的特异性（Funai等人，2020；Ono等人，2008；Park等人，2012；Torigoe等人，2012；

结论

在本研究中，我们开发了一种无需标记物且无需洗涤的电化学核酸检测方法，名为LAMP-SAP。该方法利用基于银离子适配体探针的机制，通过探针与目标序列杂交后释放银离子，将LAMP扩增产物的生成转化为电化学信号，从而实现序列特异性的信号生成。由于无需进行传统序列特异性电化学DNA检测系统中常用的探针固定化、标记和洗涤等步骤，

CRediT作者贡献说明

Hyun Gyu Park：撰写——审阅与编辑，指导，资源提供，项目管理，实验研究，资金获取。Soobin Lee：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证。Sangmo Lee：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，数据可视化，方法设计，实验研究，正式分析，数据整理，概念构建。Duck Cho：资源提供，撰写——审阅与编辑。Ki-Ho Hong：资源提供，撰写——审阅与编辑。Dongeun Yong：资源提供，撰写——

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究的资金支持来自韩国科学和信息通信部的国家研究基金会资助项目（编号为RS-2023-00218543、RS-2024-00455139和RS-2022-NR066814）。此外，本研究还得到了“韩国主导的K传感器技术发展以引领市场”技术创新计划的支持，该计划旨在开发用于超灵敏、快速多重检测呼吸道感染的完全集成电化学微流控系统。