冷冻琼脂糖辅助组织制备用于受激拉曼组织学实现周围神经完整性的快速术中评估

《Brain and Spine》：Frozen agarose–assisted tissue preparation for stimulated Raman histology enables rapid intraoperative assessment of peripheral nerve integrity

　　

背景：创伤性神经修复术中，周围神经活性的评估主要依赖外科医生的主观宏观标准。冰冻切片组织学能提供客观信息，但其常规重复使用受限于处理时间。术中受激拉曼组织学（Stimulated Raman Histology, SRH）能够对新鲜组织进行快速、无标记成像。当前术中受激拉曼组织学工作流程依赖压片制备，未能充分保留周围神经显微结构。目的：建立一种快速组织制备方案，保留真实横截面神经结构，并探究受激拉曼组织学评估周围神经切缘的可行性。方法：研究人员使用受激拉曼组织学分析了15例患者的周围神经组织。系统评估了多种组织制备策略，包括对新鲜、固定及琼脂糖包埋短时冷冻的周围神经样本进行徒手切片和引导切片。描述了工作流程耗时和图像质量。结果：徒手切片导致显著的结构扭曲，妨碍了神经束组织的可靠评估。引导切片改善了厚度控制，但切割过程中组织变形仍有限制。琼脂糖包埋后暴露于干冰1分钟，可重复生成500 μm横截面，在受激拉曼组织学中神经束结构保存良好且伪影极少。组织制备需3.5分钟。结论：冷冻琼脂糖辅助组织制备用于受激拉曼组织学（Frozen-agarose assisted tissue preparation for SRH, FA-SRH）可行且与手术流程兼容，能快速显示周围神经显微结构。因此，FA-SRH是一种有前景的补充工具，可支持周围神经修复手术中的客观术中决策。

**论文解读文章**

**研究背景与存在问题**
创伤性周围神经损伤对患者功能恢复和社会经济影响重大，常需手术修复。术中神经残端活性的评估目前主要依赖外科医生的主观视觉和触觉标准，缺乏客观性。虽然冰冻切片组织学可提供客观信息，但因其准备时间长、对手术流程干扰大，难以在反复修剪神经残端时常规使用。受激拉曼组织学（Stimulated Raman Histology, SRH）是一种无需标记、快速成像的新技术，已在神经肿瘤学中展示出接近冰冻切片的诊断性能，但其现有工作流程依赖压片制备，无法有效保留周围神经的关键显微结构——如神经束（fascicle）的组织和结缔组织鞘。因此，亟需开发一种与SRH兼容的快速组织制备方法，以在术中真实评估周围神经完整性。

**研究内容与结论**
研究人员旨在建立一种简单、快速、可重复的组织制备方法，利用SRH快速成像优势，同时最小化制备导致的伪影，以实现创伤性神经修复术中对周围神经切缘的术中评估。通过分析15例患者的不同来源周围神经组织，系统比较了徒手切片、引导切片、甲醛固定及琼脂糖包埋冷冻等方法，最终优化的冷冻琼脂糖辅助组织制备方案（FA-SRH）能在约3.5分钟内生成500 μm厚横截面，结合SRH成像（约6–7分钟）清晰显示神经束结构、髓鞘轴突及结缔组织鞘，无显著伪影。该研究证明FA-SRH可行且与手术流程兼容，可提供类似组织学的客观信息，支持术中神经残端修剪决策。论文发表在《Brain and Spine》。

**关键技术方法**
研究采用来自15例患者（包括创伤性、术后改变及诊断性神经活检标本）的周围神经组织。主要技术方法包括：1）使用NIO激光成像系统（Invenio Imaging）进行SRH成像，采集两个拉曼位移（2,845 cm^-1脂质通道和2,930 cm^-1蛋白质/DNA通道）并合成虚拟H&E样图像；2）组织制备策略：徒手切片、引导切片（使用金属切割矩阵，间隔500 μm）、甲醛固定（4%甲醛72小时）及琼脂糖包埋（3% w/v超低熔点琼脂糖）后干冰暴露（1–2分钟）冷冻；3）通过描述性评估工作流程耗时和图像质量（神经纤维可见性、神经束结构、结缔组织鞘及伪影）。

**研究结果**
**徒手切片**：对新鲜神经组织徒手切片（约1 mm厚）后压片至225 μm，SRH图像显示神经束边界和结缔组织鞘区分不清，出现纵向纤维移位和部分束被遮盖，无法可靠评估横截面结构。
**引导切片**：使用金属切割矩阵引导切片可产生约500 μm厚横截面，SRH图像中神经束、神经外膜（epineurium）和神经束膜（perineurium）可识别，但组织柔软导致切割不精确，重复性差，且出现剪切伪影。
**甲醛固定组织**：甲醛固定72小时后引导切片可生成500 μm横截面，神经束组织保存良好，伪影极少，但因固定时间过长不适合术中应用。
**冷冻琼脂糖辅助制备（FA-SRH）**：琼脂糖包埋后干冰暴露2分钟可切割，但SRH图像出现冷冻伪影；暴露时间缩短至1分钟，伪影消除，且组织硬度足以实现精确切割。在2例样本中，SRH图像显示神经束结构、神经束膜、神经外膜及神经纤维清晰可见，无挤压或冷冻伪影。组织制备总耗时约3.5分钟，根据视野大小，从组织获取到图像可用约6–7分钟。

**讨论与结论**
讨论部分指出，FA-SRH能在约6–7分钟内提供类似H&E的客观显微结构信息，有助于术中神经残端修剪决策，减少过度或不足切除。与需要20分钟的常规冰冻切片相比，SRH显著缩短了周转时间，适合反复评估。尽管SRH不能直接检测分子再生标志物，但其非破坏性特性允许后续分析。未来需建立正常和病理神经的SRH图像数据库，并与常规组织病理学及功能预后关联，整合机器学习以增强一致性。研究局限性包括：样本量有限、未进行系统性异常轴突出芽评估、未与常规组织学直接比较、图像解释为定性且未评估观察者间变异。结论部分翻译为：FA-SRH将SRH与快速可重复的组织制备方案相结合，是一种易于重复的术中辅助手段，用于评估周围神经组织。通过能在几分钟内可靠显示神经显微结构横截面，FA-SRH提供客观的组织学样信息，可支持连续神经残端切除期间的术中决策。FA-SRH旨在补充现有标准，满足快速术中反馈的需求，以改善成功神经修复的条件。需要进一步的前瞻性研究来明确FA-SRH引导神经修复对功能预后的临床影响。