《Current Opinion in Genetics & Development》：Spatiotemporal control of myonuclear identity during muscle regeneration
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骨骼肌表现出一种异常复杂的结构，其中大的多核肌纤维在其表面容纳一小群驻留的肌肉干细胞（MuSCs）。此外，肌纤维在运动神经元和肌腱的接合处含有分子和功能特化的区域。因此，该组织的再生需要一系列协调的事件，涵盖MuSCs的激活、增殖、融合以恢复肌纤维质量，以及特
骨骼肌表现出一种异常复杂的结构，其中大的多核肌纤维在其表面容纳一小群驻留的肌肉干细胞（MuSCs）。此外，肌纤维在运动神经元和肌腱的接合处含有分子和功能特化的区域。因此，该组织的再生需要一系列协调的事件，涵盖MuSCs的激活、增殖、融合以恢复肌纤维质量，以及特化区域的重建。近期的进展开始揭示肌源性细胞核如何响应与周围细胞类型的相互作用而发生动态状态转变，以及这些状态如何在再生过程中被重塑。在此，研究人员讨论肌核可塑性和空间特化的新兴原理。
### 引言
骨骼肌对于运动系统和全身生理至关重要，其再生能力对健康、衰老和损伤恢复至关重要。骨骼肌的一个标志性特征是其独特的细胞结构：单个肌纤维是通过发育过程中单核前体细胞融合形成的大型多核合胞体。在成体肌肉中，再生依赖于位于基底层下方的一小群肌肉干细胞（MuSCs，也称为卫星细胞）。损伤后，MuSCs退出静息状态，增殖、分化并融合以修复受损纤维，从而向合胞体提供新的细胞核。这些转变伴随着协调的转录和表观遗传重编程，使骨骼肌成为研究组织修复过程中细胞可塑性的强大系统。
由于MuSCs的数量远少于肌纤维的大小和长度，再生需要大量的前体细胞扩增（约50倍）和高效融合。新整合的细胞核随后必须在共享的细胞质中发挥功能，并沿纤维整合空间信号。MuSCs来源的细胞核如何适应其转录程序并与预先存在的肌核协调，仍不完全清楚。
进一步增加复杂性的是，肌纤维被组织成特化的亚细胞结构域，最突出的是神经肌肉接头（NMJ）和肌肌腱连接（MTJ），它们分别对突触传递和力传递至关重要。这些结构域由不同的分子结构和与周围细胞类型的相互作用定义。值得注意的是，这些特化结构域中的肌核尽管与其他细胞核共享细胞质，却具有独特的转录谱。因此，成功的肌肉再生不仅需要恢复肌纤维质量，还需要精确重建结构域特异性的组织。理解肌核程序如何在发育和再生过程中被指定、维持和重塑，是骨骼肌生物学的一个核心挑战。
在本综述中，研究人员使用术语“肌纤维结构域”来指代肌纤维内这些功能不同的区域，这应与“肌核结构域”的概念区分开来，后者认为单个细胞核支持特定体积的细胞质。感兴趣的读者可参考相关综述以全面了解肌核结构域生物学。除非另有说明，本文讨论的大多数研究均来自小鼠模型。
### 肌肉干细胞静息和分化的调控
早期对肌源性重编程的研究确立了骨骼肌作为细胞可塑性的范例。非肌肉细胞与肌源性细胞的融合表明肌肉身份可以被主导性地施加，这导致MyoD和肌源性调节因子家族被鉴定为肌源性命运的关键转录驱动因子。这些发现揭示了肌源性分化由一个分层的转录网络控制，该网络指定肌肉身份并驱动分化相关的基因表达。
在成体骨骼肌中，MuSCs通过经历不同的调控状态在再生过程中重现这种可塑性。重要的是，这些转变发生在与周围微环境持续相互作用的空间约束内，并由特定的细胞内结构域驱动。理解这些状态转变如何被调控，对于定义MuSCs来源的细胞核如何获得融合能力并功能性整合到再生肌纤维中至关重要。
#### MuSCs静息状态
MuSCs的一个标志性特征是它们延长的静息状态，这使其与造血或上皮组织中持续增殖的干细胞群体区分开来。由于骨骼肌的基础更新率低，MuSCs在长时间内保持休眠，同时保留快速响应损伤而激活的能力。重要的是，静息状态由微环境来源的协调信号主动维持。
MuSCs被夹在肌纤维质膜和周围的基底层之间，形成一个高度极化的微环境，这对于维持静息状态至关重要。来自肌纤维侧的顶端表面和富含细胞外基质的基底表面的信号协同作用以抑制激活。其中，Notch信号发挥核心作用。通过Rbpj突变对Notch的遗传抑制导致成体MuSCs退出静息状态并分化，导致干细胞耗竭。一致地，Hes/Hey家族的Notch靶基因保持未分化的静息状态。除了在成体稳态中的作用，Notch信号还通过促进发育过程中卫星细胞微环境的定植发挥作用。相反，组成性Notch激活维持Pax7表达并促进自我更新。
同时，Notch信号通过自分泌微环境机制加强静息状态，即促进胶原蛋白V分泌以及通过降钙素受体（Calcr）和cAMP-PKA通路的下游信号，从而将顶端Notch输入与基底细胞外基质线索联系起来。Notch信号的破坏足以诱导过早激活和分化。
细胞-细胞粘附通过M-和N-钙粘蛋白介导的同型相互作用进一步巩固静息状态，这些相互作用稳定粘附连接并锚定肌动蛋白-肌球蛋白复合物在MuSCs-肌纤维界面。这些连接被认为将粘附与细胞骨架组织和极性通路（包括aPKC-PAR复合物）耦合，从而将微环境几何结构与干细胞行为联系起来。
除了转录控制，MuSCs还通过转录后机制维持一种待命状态。关键的肌源性mRNA被隔离在细胞质核糖核蛋白（mRNP）颗粒中，阻止过早翻译，同时保留快速激活潜力。与此一致，在退出静息状态时通常观察到mRNP颗粒的溶解。总之，这些机制确立了静息状态是一种严格调控、空间组织有序的状态，使MuSCs为及时激活做好准备。
#### 激活和增殖
MuSCs退出静息状态后，它们重新进入细胞周期以扩增再生所需的肌源性前体细胞池。这一转变伴随着广泛的转录和代谢重编程。值得注意的是，第一次分裂发生在36到48小时之间，而后续分裂仅需8-10小时。在这个延长的分裂前阶段，MuSCs从G0期过渡到G1期，进入一种称为G
alert的准状态，细胞大小、线粒体含量和蛋白质翻译增加。
早期MuSCs激活由信号级联驱动，这些信号快速重塑细胞骨架组织，例如通过Rac和Rho家族小GTP酶介导的细胞突起回缩，以及通过初级纤毛解体以激活Gli依赖的Sonic hedgehog通路。在损伤后数小时内，立即早期基因Fos和Jun被强烈诱导，形成AP-1转录因子复合物，该复合物结合基因组中的增强子区域并促进细胞周期调节因子（如Myc和Ras）的表达。Rho依赖的细胞骨架信号通过MRTFA的核易位促进AP-1诱导，而这一响应随后被p38 MAPK和MEK/ERK通路放大。总之，这些通路启动细胞周期进入的表观遗传重塑。
随着MuSCs增殖，必须维持自我更新和肌源性分化之间的平衡，以确保前体细胞扩增同时防止过早分化。这种平衡由再生微环境的反馈塑造。巨噬细胞分泌多种可溶性因子（如代谢物、外切酶、生长因子），在损伤早期促进MuSCs激活和分裂。同时，纤维脂肪祖细胞（FAPs）是哨兵间充质细胞，也在损伤后激活并分化为成纤维细胞，提供时间上不同的信号：首先促进MuSCs激活和增殖，随后支持分化和组织修复。FAPs通过产生细胞外基质成分和旁分泌信号调节再生微环境，影响MuSCs扩增和不对称自我更新，而失调的FAPs活动在病理背景下导致脂肪浸润和纤维化。值得注意的是，肌肉再生过程中MuSCs的动态及其与微环境细胞的相互作用在脊椎动物中是保守的，如在斑马鱼损伤诱导的再生模型中所示。
#### 分化和融合
肌源性分化的承诺涉及协调的细胞周期退出和肌肉特异性转录程序的激活，这些程序为肌源性前体细胞融合做准备。这一过程由MyoD和肌细胞生成素依赖的基因网络驱动，该网络促进膜融合和早期肌节组装所需基因的表达。重要的是，分化建立了融合能力，但并不代表终末转录状态。
这一转变的一个关键组成部分涉及与代谢调节耦合的表观遗传重塑。线粒体乙酰辅酶A产生的短暂限制限制了细胞周期基因的组蛋白乙酰化，从而使MyoD和肌细胞生成素能够激活肌肉特异性转录程序。晚期肌源性靶基因的表达包括融合因子Myomaker和Myomixer，而协调的细胞骨架重排产生基于肌动蛋白的突起，促进膜并置和融合孔形成。
分化的肌细胞融合到现有或新形成的肌纤维中代表了一个额外的调控检查点。整合到合胞体后，MuSCs来源的细胞核必须适应共享的细胞质环境，并从分化相关的转录状态转变为成熟的肌核程序。这一过程伴随着分化诱导因子（如肌细胞生成素）的下调，以及与肌节组织、兴奋-收缩耦联和代谢特化相关基因的诱导。
与持续的融合同时，这些肌核的定位也动态变化。在初始融合时，肌核位于肌管中央，通常形成核链，这与增加的转录活性相关。随着肌管成熟和生长，大多数肌核重新定位到外周位置。虽然这种中央到外周的重定位在发育过程中非常高效，但在再生小鼠肌肉的高内涵成像研究中显示，相当一部分肌核在再生背景下仍保持中央位置。有趣的是，每个肌核的转录输出与肌核数量成反比（即核数增加伴随着每个核的转录减少），这表明在肌肉再生过程中可能发生肌核转录的灵活适应。最近的研究通过脉冲标记MuSCs来源的细胞核，结合批量RNA测序和单核RNA测序（snRNA-Seq），开始更详细地定义新融合细胞核在发育和出生后不同背景下的转录轨迹。这些分析揭示了一个保守的融合后早期程序以及响应生理挑战（如运动）的依赖于背景的分化。总之，这些发现表明，融合不仅是肌生成的终末步骤，还启动了另一层核重编程，这是功能性整合到肌纤维中所必需的。
### 肌纤维结构域的再生
除了重建肌纤维主体，有效的肌肉再生还需要恢复连接肌纤维与运动神经元和肌腱的特化亚细胞结构域。近期的单核转录组分析揭示，这些区域内的肌核采用了与沿纤维分布的肌核不同的转录状态，这意味着结构域再生涉及超出一般肌生成的额外核重编程层。这在人类肌肉中也有观察到，单核转录组学已鉴定出转录特化的NMJ和MTJ肌核。
#### 神经肌肉接头（NMJ）
NMJ是多种疾病中的主要功能障碍部位，包括先天性和自身免疫性肌无力综合征、运动神经元疾病以及与衰老相关的去神经支配。虽然对突触传递所需分子机器的局部表达和翻译已有广泛表征，但关于突触后肌核如何被指定以及其身份如何在再生过程中得以恢复，直到最近才开始被研究。
单核转录组分析为肌核对NMJ扰动的响应提供了关键见解。去神经支配模型揭示了涉及NMJ富集和突触外肌核的广泛转录响应，包括与肌纤维大小相关的Gramd1基因的调控。对去神经支配、肉毒毒素处理和MuSK缺陷肌肉的互补分析鉴定了依赖于持续突触信号的突触后转录本，并揭示了Pdzrn4通过调节MuSK转运在NMJ生物学中的作用。更近期，一个涵盖生长和萎缩状态的骨骼肌图谱显示，NMJ相关的转录程序在不同的病理生理背景下被重塑，并鉴定了终末施万细胞与NMJ肌核之间的TGF-β介导的串扰。总之，这些发现确立了一个核心原则：NMJ肌核身份不是固定的，而是需要连续的突触输入。神经支配的丧失导致NMJ特异性转录程序的侵蚀，同时诱导非NMJ肌核中更类似胚胎的状态。
将神经活动与肌纤维内转录调控联系起来的分子通路正开始被定义。钙依赖的信号通过NFAT和MEF2C长期以来被认为在慢肌纤维中起作用，而最近的研究将大Maf转录因子鉴定为快肌纤维中活动依赖性基因调控的关键介质，它们维持纤维类型身份并抑制去神经支配诱导的萎缩程序。这些通路是局部作用于NMJ相关肌核，还是更广泛地作用于整个合胞体，仍是一个重要的未解问题。
除了肌核内在机制，NMJ再生依赖于从肌肉到运动神经元及其周围胶质细胞的逆行因子。去神经支配的肌肉上调促衰老酶15-前列腺素脱氢酶（15-PGDH），该酶降解前列腺素E2，而对该通路的药理学抑制增强了去神经支配和衰老模型中的NMJ修复。其他研究表明，去神经支配的肌纤维分泌因子，促进MuSCs在去神经支配后优先在NMJ附近融合，从而维持突触下核的数量。有趣的是，一项近期研究显示，Smn基因（在脊髓性肌萎缩症中突变）的单拷贝缺失导致运动神经元缺陷。总之，这些观察强调了肌纤维及其微环境在神经支配丧失后主动塑造突触前再生和NMJ恢复的能力。
肌纤维结构域生物学（包括下文讨论的MTJ）的另一个重要方面是生物分子扩散的挑战。为了建立和维持结构域身份和功能，局部产生的转录本和蛋白质必须保留在肌纤维的特定区域。虽然这个问题已针对一般肌核进行了研究，但对于特化肌核可能尤其关键，因为即使关键调节因子的适度扩散也可能破坏空间限制的程序。
#### 肌肌腱连接（MTJ）
与NMJ相比，MTJ的生物学研究相对较少，尽管它经常是机械应力、损伤和断裂的部位。MTJ的特征是独特的指状膜内陷，增加了肌肉和肌腱之间力传递的表面积。尽管在形态学上早已被认识，但其分子组织和再生机制直到最近才开始被解析。专门的MTJ特异性损伤模型仍然有限，并且控制MTJ再生的原理仍不明确。
近期工作开始阐明该结构域的起源和细胞组成。具有双重身份的特化成纤维细胞样群体选择性地在肌纤维末端融合以产生MTJ相关的肌核。发育单细胞分析进一步表明，肢体结缔组织成纤维细胞形成位置身份的连续体，成纤维细胞多样化部分由肌肉收缩塑造。在成熟MTJ，空间蛋白质组学揭示了肌肉-肌腱过渡区的代谢特化，而人肌纤维末端的高分辨率组织学分析显示了单核细胞和肌核的纤维类型特异性组织。补充这些观察，snRNA-seq研究鉴定了在MTJ肌核中选择性富集的转录程序。总之，这些发现确立了MTJ是一个分子特化的结构域，而不仅仅是肌纤维主体的简单延伸。
将全纤维再生与肌肉-肌腱界面的结构域重建分开的实验模型也正在出现。跟腱切除术后跖肌的代偿性肥大长期以来被用于研究肌肉生长，但其对MTJ身份和转录可塑性的影响尚未被系统检查。重新利用该模型可能有助于确定MTJ特异性转录程序是否在扰动后可逆（类似于NMJ的观察结果）。更近期，Yamamoto及其同事开发了一种损伤模型，其中在跟腱和比目鱼肌之间注射胶原酶诱导局灶性MTJ破坏，从而能够对MTJ及邻近区域的再生进行时间分辨分析。
该领域的一个主要限制仍然是缺乏允许选择性操作和分子询问单个肌纤维结构域的工具。在此背景下，最近开发的允许对MTJ进行靶向遗传操作的病毒工具代表了一个重要进步。在结构域特异性的遗传和空间技术方面的持续进步，对于定义控制MTJ再生的调控原理以及将MTJ生物学整合到空间组织化肌肉修复的更广泛框架中将至关重要。
### 结论与展望
骨骼肌再生为研究成体组织中的细胞可塑性和核重编程提供了一个独特且易于处理的系统。与许多以多分支谱系层次为特征的器官相比，肌源性程序遵循相对线性的轨迹，使得调控每个转变的分子事件能够以异常清晰的方式被解析。这种结构简单性使得对干细胞状态如何控制以及再生能力如何维持的深入机制理解成为可能。
同时，肌肉表现出将其与其他系统区分开的额外复杂性：多个核命运共存于一个共享的细胞质中。肌核并非肌生成的均匀终末产物，而是采用空间特化的身份，这些身份由位置线索、微环境相互作用和生物分子扩散持续塑造。理解不同的核状态如何在合胞体中被指定和协调，可能为其他多核或高度组织化组织（包括胎盘、破骨细胞以及某些心脏或上皮系统）中的核异质性提供更广泛的概念性见解。随着空间和单核技术的持续进步，骨骼肌有望继续成为揭示细胞可塑性和核特化一般原理的强大模型。
