非神经元乙酰胆碱诱导的一氧化氮信号传导可促进Mythimna separata的马尔皮基管中的液体转运

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Non-neuronal acetylcholine-induced nitric oxide signaling promotes fluid transport in Malpighian tubules of Mythimna separata

【字体：大中小】 时间：2026年07月17日 来源：Insect Biochemistry and Molecular Biology 4.3

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在M. separata的肌管中，mAChR通过PLC-IP₃R途径触发由ACh诱导的钙离子信号。
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钙离子依赖性的NOS1在M. separata的肌管主细胞中特异性表达。
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首次证明昆虫中的非神经元ACh能够刺激[NO]_i的产生。
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非神经元ACh诱导的NO可提升M. separata肌管中的cGMP水平。
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非神经元ACh通过NO-cGMP信号通路刺激M. separata肌管的分泌功能。

引言

乙酰胆碱作为典型的神经递质早已被广泛认知。越来越多的证据表明，它也是一种具有古老进化历史的信号分子，在各种生物体中普遍存在（Wessler等人，1999；Wessler和Kirkpatrick，2017）。在哺乳动物中，非神经元细胞也能合成ACh，它以自分泌/旁分泌方式调节细胞的增殖、分化、分泌、免疫反应以及繁殖等基本功能（Grando等人，1993a，b；Reinheimer等人，1996；Klapproth等人，1997；Wessler等人，1998，1999；Fujii和Kawashima，2001；Chakraborty等人，2025）。然而，昆虫马氏管中的非神经元ACh系统直到最近才被研究。转录组分析显示，Trichoplusia ni的幼虫马氏管中存在ACh受体基因（Kolosov和O’Donnell，2019；Kolosov等人，2019）。我们最近的研究在Mythimna separata的肌管中发现了非神经元ACh系统，其中ACh由主细胞中的肉碱乙酰转移酶合成，通过A型毒蕈碱乙酰胆碱受体发挥作用，提升细胞内的钙离子浓度([Ca²⁺]_i)（Zhan等人，2024）。类似地，在Rhodnius prolixus的肌管中也发现了非神经元ACh系统，它能刺激分离出的肌管分泌液体（Orchard等人，2025）。不过，ACh作用的详细机制以及相关的信号通路至今仍不十分清楚。

昆虫的肌管是调控渗透压和排泄功能的关键器官。它们负责从血淋巴中分泌初始尿液，并与后肠一起精确调节离子、水分以及代谢废物的平衡（Halberg和Denholm，2024）。肌管没有神经支配，其液体分泌功能是由多种神经肽家族调控的，比如昆虫激肽、降钙素样利尿激素、CRF相关利尿激素、capa肽，某些物种中还有5-羟色胺（5-HT）起作用（O'Donnell和Spring，2000；Coast，2011；Schooley等人，2012；Orchard等人，2021）。钙离子和一氧化氮是这一过程中两个关键的第二信使。例如，在蟋蟀和蚊子中，5-羟色胺和激肽可通过激活钙离子信号通路来促进肌管分泌（Coast，2011；Beyenbach，2012）。在这些调控因子中，Drosophila melanogaster中的capa肽信号通路已被研究得最为透彻。capa神经肽作用于主细胞中的相应受体，提升[Ca²⁺]_i浓度，进而激活钙离子依赖性的氧化氮合酶（NOS1）（Davies等人，1997；Rosay等人，1997；Pollock等人，2004）。由此产生的NO会提升细胞内的cGMP水平，最终促使液体分泌（Dow等人，1994；Davies等人，1995；Kean等人，2002）。这一级联反应构成了一条典型的信号传导轴，其中钙离子作为关键的第二信使，将受体激活与下游效应因子联系起来。

一氧化氮是由一类NOS酶通过将L-精氨酸氧化为L-瓜氨酸而内源生成的。在哺乳动物中，已鉴定出三种NOS同工酶：神经元NOS（nNOS/NOS1）、内皮细胞NOS（eNOS/NOS3）以及诱导型NOS（iNOS/NOS2）。NOS1和NOS3是钙离子依赖型的，且持续表达，而NOS2则不受钙离子调控，主要在受到炎症或免疫刺激时才会表达出来（Moroz等人，2011）。据报道，昆虫的NOS酶在序列上与脊椎动物的NOS1最为相似（Regulski等人，1995；Yuda等人，1996；Nighorn等人，1998；Watanabe等人，2007；Imamura等人，2002），或者表现出介于持续表达型和诱导型脊椎动物NOS之间的特征（Luckhart等人，1998）。值得注意的是，昆虫的NOS基因通常根据序列相似性被命名为NOS1和NOS2（Tanaka等人，2008；Liu等人，2020；Chen等人，2022），但它们与三种脊椎动物NOS同工酶并不存在一一对应的同源关系。

昆虫肌管中的一氧化氮信号通路已被深入研究（Dow等人，1994；Davies等人，1995；Rosay等人，1997）。在Drosophila的肌管中，研究表明只有与脊椎动物NOS1同源的一种NOS参与液体的运输过程（Regulski等人，1995；Davies等人，2013）。此外，capa神经肽引发的NO释放也会提高Drosophila肌管中的cGMP水平（Davies等人，1995；Kean等人，2002），这与已有的机制一致，即细胞内钙离子浓度的上升是激活钙离子依赖型NOS（如nNOS）的必要条件，这类NOS随后会产生NO，进而引发下游的cGMP信号传导，最终调控多种生理过程（Davies，2000）。作为第二信使，cGMP也被证实能增加D. melanogaster肌管中的跨上皮电位差，从而促进液体分泌（Dow等人，1994；Davies等人，1995）。因此，cGMP和NO在调控肌管分泌功能时往往具有协同作用。

鉴于非神经元ACh也能提升M. separata肌管中的[Ca²⁺]_i浓度（Zhan等人，2024），一个关键问题随之产生：ACh诱导的钙离子信号是否会进一步激活钙离子依赖型的NOS-NO-cGMP通路，从而推动液体分泌？基于上述研究背景，本研究旨在：（1）确定肌管中ACh诱导的钙离子信号是否通过磷脂酶C和IP₃R途径传递；（2）在转录和细胞层面识别并定位肌管中钙离子依赖型NOS1的表达位置；（3）探究ACh对分离出的肌管中NOS酶活性以及[NO]_i浓度的影响；（4）研究ACh对cGMP水平的影响；（5）评估ACh对肌管液体分泌功能的实际作用。本研究表明，非神经元ACh可通过PLC-IP₃R-Ca²⁺-NOS-cGMP信号级联反应，促进昆虫肌管的液体分泌。

章节要点

昆虫

M. separata的幼虫在25℃、50%相对湿度环境下，按照16小时光照/8小时黑暗的周期，通过人工饲料饲养。在蛹期将雄虫和雌虫分开，分别放在塑料培养皿中饲养。成虫则喂食5%的蜂蜜水以维持营养。

化学试剂

乙酰胆碱氯化物、U-73122和2-氨基乙基二苯硼酸酯（2-APB）购自Sigma Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯市）。阿托品、8-溴-cGMP和ODQ则由MedChemExpress公司（美国新泽西州）提供。

PI信号通路参与ACh诱导的肌管内[Ca²⁺]_i升高

为探究PI信号通路是否参与ACh诱导的肌管内[Ca²⁺]_i升高现象，我们在用ACh刺激之前，先使用特定的磷脂酶C抑制剂（U-73122）或IP₃R拮抗剂（2-APB）处理负载了Fluo-4 AM的肌管。那些预先用10 μM U-73122处理30分钟的肌管，在接触50 μM ACh后并未出现显著的[Ca²⁺]_i升高现象，而单独接触50 μM ACh时则会出现明显的响应（见图1）。这一结果表明磷脂酶C在这一过程中起着重要作用。

讨论

目前已知，哺乳动物中的非神经元胆碱能系统可调控多种基本细胞功能，比如分泌与吸收、增殖与分化、繁殖以及免疫功能（Wessler等人，2017；Tian等人，2022）。不过，关于昆虫中这一系统的研究仍然有限。我们之前的研究已经发现，草地贪夜蛾M. separata的卵巢和肌管中存在非神经元ACh系统的相关成分（Lü等人，2020；Tian等人，2022；Zhan等人，2024）。非神经元ACh

CRediT作者贡献说明

Shumin Lü;: 文章撰写——审阅与编辑、研究指导、资源提供、资金获取、数据整理、概念构思。Weining Cheng: 资源提供、概念构思。Yutong Wan: 方法设计、实验实施。Baijun Sheng: 实验实施。Xinjie Deng: 实验实施。Lei Yi: 数据可视化、实验实施。Dong Cheng: 文章撰写——初稿编写、数据可视化、软件应用、方法设计、实验实施、正式数据分析

未引用参考文献

Browne和O'Donnell，2016；Elphick，1997；Grando等人，1993；Irvine，1969；Kolosov和O'Donnell，2019；Morhardt，1970；Moroz和Kohn，2011；Regulski和Tully，1995；Schellinger和Rodan，2015；Schimerlik，1989。

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性声明

本研究的相关数据可在合理请求下向通讯作者获取。

资助情况

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号31101442和31872307）以及中国陕西省的重点研发计划（项目编号2025NC-YBXM-050）的支持。

致谢

我们衷心感谢美国堪萨斯州恩波里亚市的恩波里亚州立大学John Richard Schrock博士对手稿的校对工作。

引言