《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Optimizing stimulation parameters: transpalpebral and transbrain electrical stimulation for retinal protection in RCS rats
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引言：视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa, RP）是一组遗传性异质性视网膜病变，导致光感受器死亡与失明。电刺激（Electrical stimulation, ES）是一种有前景的非侵入性神经保护策略。本研究探讨了在皇家外科医师学院（Ro
引言：视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa, RP）是一组遗传性异质性视网膜病变，导致光感受器死亡与失明。电刺激（Electrical stimulation, ES）是一种有前景的非侵入性神经保护策略。本研究探讨了在皇家外科医师学院（Royal College of Surgeons, RCS）大鼠胆囊经（Gallbladder meridian）穴位（GB14、GB16、GB20）施加经睑电刺激（Transpalpebral ES, TpES）与经脑电刺激（Transbrain ES, TbES）的神经保护效应，并确定每种模式的最佳参数。方法：RCS大鼠随机分为对照组、假刺激组、TpES组（200、400、600、800 μA）和TbES组（15、30、50、100 Hz）。从6周龄起每日给予刺激，持续14天。通过旷场试验（Open-field test, OFT）评估视觉引导行为。通过视网膜电图（Electroretinography, ERG）、彩色眼底照相（Color fundus photography, CFP）、频域光学相干断层扫描（Spectral-domain optical coherence tomography, SD-OCT）和组织病理学评价视网膜功能与形态。通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling, TUNEL）量化光感受器凋亡。通过免疫荧光和数字PCR检测神经营养因子（BDNF、CNTF、bFGF、NGF）及c-Fos。结果：OFT显示未经治疗的对照组大鼠呈现进行性焦虑样行为，但不能排除非视觉混杂因素。所有刺激组均表现出与假刺激组相当的稳定运动活动，无行为异常或全身不良反应。所有刺激组均表现出与假刺激组相当的稳定运动活动，无不良反应。800 μA的TpES与50 Hz的TbES对视网膜结构与功能的保存最为显著，维持了3–4层光感受器细胞，而对照组仅为1–2层。800 μA的TpES使凋亡指数降低约35%；所有TbES频率均将其降至相似范围，表明存在频率无关的抗凋亡阈值。两种模式均上调BDNF和bFGF；TbES（尤其是50 Hz）额外上调了CNTF和NGF，此模式在TpES组中未见。升高的c-Fos证实了内丛状层视网膜神经元激活。结论：优化的TpES（800 μA）与TbES（50 Hz）均发挥神经保护作用，保存视网膜功能与结构，减少凋亡并上调神经营养因子，且无行为或全身副作用。这些眼-脑电刺激方法基于传统中医经络理论与现代神经调控，为临床转化提供了循证参数，代表了一种有前景的协同策略。
该研究背景立足于视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa, RP）作为一种遗传性视网膜营养不良（Inherited retinal dystrophies, IRDs），全球患病率为1/5000，主要影响视杆和视锥光感受器，导致进行性视网膜变性与不可逆视力损伤。目前基因与干细胞疗法受限于特定遗传背景及侵入性风险，亟需开发安全有效的非侵入性策略。电刺激（Electrical stimulation, ES）作为神经保护手段具有潜力，其中经睑电刺激（Transpalpebral ES, TpES）通过眼睑皮肤传递微电流至眼后段，经脑电刺激（Transbrain ES, TbES）通过头皮调节皮层及皮下神经元活动以增强视觉皮层可塑性。研究结合传统中医足少阳胆经（Foot Shaoyang Gallbladder meridian）穴位（GB14阳白、GB16目窗、GB20风池）与现代神经调控，旨在RCS（Royal College of Surgeons）大鼠模型中优化TpES电流幅度（200–800 μA）与TbES频率（15–100 Hz）参数并评估其神经保护效应。研究结论表明，优化的TpES（800 μA）与TbES（50 Hz）能显著保存视网膜功能与结构、减少光感受器凋亡并上调神经营养因子，且无非视觉副作用，为RP临床管理提供了基于证据的全视觉系统保护框架。该论文发表于《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。
研究人员主要采用的关键技术方法包括：使用雄性及雌性体重150–200 g的RCS大鼠（购自中国医学科学院医学实验动物研究所）作为遗传性光感受器变性模型；随机分组为对照组、假刺激组、4个TpES电流幅度组（200、400、600、800 μA）及4个TbES频率组（15、30、50、100 Hz），自6周龄起每日刺激5分钟持续14天；通过旷场试验（Open-field test, OFT）评估运动活动与视觉引导行为；应用视网膜电图（Electroretinography, ERG）评估视网膜功能；利用彩色眼底照相（Color fundus photography, CFP）与频域光学相干断层扫描（Spectral-domain optical coherence tomography, SD-OCT）评估体内视网膜形态；通过苏木精-伊红（Hematoxylin and eosin, HE）染色定量外核层（Outer nuclear layer, ONL）厚度；采用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling, TUNEL）染色量化光感受器凋亡；运用免疫荧光（Immunofluorescence, IF）检测脑源性神经营养因子（BDNF）与c-Fos蛋白定位；使用数字PCR（Digital PCR, dPCR）绝对定量CNTF、BDNF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、神经生长因子（NGF）及c-Fos的mRNA表达。
研究结果部分如下：
3.1 Transpalpebral and transcranial ES do not impair locomotor behavior or induce systemic side effects in RCS rats。研究人员通过OFT在刺激开始后7天和14天评估发现，所有TpES（200–800 μA）与TbES（15–100 Hz）组均未观察到异常运动特征（转圈、冻结、震颤或癫痫样多动），表明无神经系统或全身毒性。总移动距离与平均速度在各刺激组与假刺激组间无显著差异，基本运动功能得以保留。对照组呈现进行性探索改变（总距离增加38.9%，中心停留时间增加80%），而200 μA TpES与30 Hz TbES组表现为中心区探索减少但总运动能力未受损，反映空间策略改变而非运动障碍。证实两种模式在胆囊经穴位递送耐受良好且无行为异常。
3.2 Optimal parameters of TpES and TbES improve retinal function in RCS rats。研究人员通过ERG在7天与14天评估发现，TpES中800 μA组在暗视杆b波、最大混合反应、振荡电位（Oscillatory potentials, OPs）及明视锥b波振幅最高且显著优于对照组与假刺激组；TbES中50 Hz组在上述参数及10 Hz闪烁P波振幅亦表现最佳。14天时各刺激组ERG振幅仍优于模型组，800 μA TpES与50 Hz TbES在明视锥b波等参数上维持显著优势，波形定性观察显示最优参数组在14天仍保留可测反应而对照组近乎熄灭，表明800 μA（TpES）与50 Hz（TbES）对杆-锥介导的视网膜反应具有持续改善作用。
3.3 ES at optimal parameters attenuates retinal structural degeneration in RCS rats。研究人员通过CFP与SD-OCT发现，所有组在7天与14天均见视网膜血管迂曲及色素斑点，但定量SD-OCT显示800 μA TpES在各偏心距下视网膜厚度保存最优，呈电流幅度依赖性；TbES中50 Hz条件视网膜厚度最大。HE染色显示14天时对照组与假刺激组ONL仅余1–2层细胞且内外节（Inner/outer segments, IS/OS）严重破坏，而800 μA TpES与50 Hz TbES组维持3–4层ONL并较好保留层状结构。定量显示800 μA组ONL厚度（184.67 ± 11.88 μm）显著大于对照组（120.80 ± 9.77 μm）与假刺激组（105.47 ± 16.54 μm），50 Hz TbES组（141.73 ± 26.46 μm）数值上大于对照但与对照比未达显著，仅显著大于30 Hz组，表明参数优化对退行视网膜组织学保存至关重要。
3.4 ES reduces photoreceptor apoptosis and preserves outer nuclear layer integrity。3.4.1小节中，研究人员通过HE染色定量ONL厚度确认最优参数下光感受器结构保存。3.4.2小节中，TUNEL染色显示凋亡细胞主要定位于ONL，对照组与假刺激组凋亡指数最高（约0.54–0.55）。800 μA TpES组凋亡指数降至0.35（较对照降低约35%）且具有显著性；TbES各频率（15、30、50、100 Hz）均将凋亡指数降至0.39–0.40范围但未达显著。TpES中200 μA组凋亡细胞数减少但无统计显著，TbES中15 Hz与100 Hz亦呈类似趋势，表明TpES在800 μA具显著抗凋亡效应，TbES呈频率无关的抗凋亡阈值倾向。
3.5 ES upregulates neuroprotective gene and protein expression in the degenerating retina。研究人员选取800 μA TpES、600 μA TpES、50 Hz TbES与100 Hz TbES进行分子分析。免疫荧光显示BDNF与c-Fos免疫反应性主要定位于内核层（Inner nuclear layer, INL）与神经节细胞层（Ganglion cell layer, GCL），对照组与假刺激组信号极低，800 μA与50 Hz组荧光最强。dPCR显示50 Hz与100 Hz TbES组睫状神经营养因子（CNTF）mRNA显著上调（50 Hz: 1.91 ± 0.35），800 μA TpES呈趋势仅对假刺激显著；BDNF mRNA在所有刺激组显著上调，50 Hz（24.63 ± 0.88）与800 μA（22.32 ± 1.17）达约22–25倍增加；bFGF mRNA在50 Hz（5.67 ± 1.38）与800 μA（4.31 ± 0.25）最高；NGF mRNA仅在TbES组（50 Hz: 12.28 ± 4.55；100 Hz: 10.80 ± 2.73）显著上调，TpES未见此模式；c-Fos mRNA在50 Hz（14.17 ± 1.34）与800 μA（4.55 ± 0.50）显著上调。表明TbES（尤50 Hz）诱导更广泛的神经营养因子谱（含CNTF、NGF），而两者均上调BDNF、bFGF与c-Fos。
讨论部分总结：研究人员指出本研究在RCS大鼠模型证实TpES（800 μA）与TbES（50 Hz）沿胆经穴位递送具参数依赖性神经保护，能最优保存功能、结构、降低凋亡及上调分子表达，但800 μA与50 Hz是各自模式内最优而非互为等效。OFT中对照组进展性变化虽与视力丧失相关但不能排除疼痛或应激，刺激组无异常支持行为安全性但OFT为间接指标。ERG与OCT/HE结果与前人经角膜或经巩膜ES研究一致，强调参数特异性及靶向细胞类型差异。抗凋亡方面TpES 800 μA显著降低指数，TbES呈频率无关阈值；分子机制上TbES独有上调CNTF与NGF，可能与经颅刺激激活全视皮质轴及Müller细胞微环境差异有关，c-Fos升高标志内视网膜神经元激活。研究整合中医经络与现代神经调控提出眼-脑协同保护框架。局限性包括14天观察期短、单一MERTK突变模型、OFT非视觉专用、样本量小及未做性别分层、未全面分析代谢与炎症通路、未评估联合刺激。结论翻译为：优化的TpES（800 μA）与TbES（50 Hz）各自发挥神经保护效应，保存视网膜功能与结构，减少凋亡并上调神经营养因子，且无行为或全身副作用。这些基于传统中医经络理论与现代神经调控的眼-脑电刺激方法，为临床转化提供了循证参数，代表了一种有前景的协同策略。
