紫杉醇功能化的各向异性OVA纤维支架：对施万细胞与背根神经节生长行为的协同调控

《Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects》：Paclitaxel-functionalized anisotropic OVA fibrous scaffolds: Synergistic regulation of schwann cells and DRG growth behavior

　　明珠贾|乐乐王|远超赵|鑫金|霍云沈|玉清尚|新月赵|凌燕邢|鸿芳吴|贵才李

摘要：长段周围神经损伤的修复仍是临床上的重大挑战。自体神经移植作为标准治疗方法，却因供体来源不足及供体部位并发症而受到限制。作为一种有前景的替代方案，人工神经引导导管通过拓扑引导与生物活性功能化相结合来促进神经再生，已成为周围神经修复的关键策略。卵白蛋白具有优异的生物相容性和可降解性，而紫杉醇则能促进轴突生长。然而，将二者结合用于治疗长段周围神经损伤的研究仍较为缺乏。本研究中，通过电纺技术制备了各向异性拓扑卵白蛋白纤维支架，再通过多巴胺介导的表面修饰，将紫杉醇稳定固定在该支架上，从而得到经紫杉醇功能化的拓扑支架，旨在提升神经修复效率。各项表征结果显示，该支架具有良好的物理化学性质、出色的细胞相容性以及显著的抗菌活性。体外实验表明，这种复合支架能够显著促进施万细胞的增殖与迁移，同时还能有效调控背根神经节轴突的方向性，引导轴突沿支架方向有序生长。从机制上看，该支架可上调Yap、Egr2和Calm3的表达，同时抑制促炎细胞因子TNF-α的分泌。这项体外研究证实了所制备支架的优良物理化学性能、生物相容性及生物学功能，为开发新型神经修复支架提供了良好的实验基础和设计参考。

引言：周围神经损伤是一种常见的临床疾病，由牵拉伤、切割伤、枪伤、压迫伤、缺血等多种原因导致暂时性或永久性的神经功能障碍[1][2][3][4]。这类损伤会破坏神经信号传导通路，阻碍信息传递[5][6]，进而影响患者的感觉和运动功能，严重降低其生活质量[7][8][9]。以往研究表明，对于短距离的周围神经损伤，显微外科神经吻合术是首选治疗方法，术后可使患者的神经功能部分恢复。而对于神经缺损较长的情况，由于无法进行无张力的神经吻合，就需要进行神经移植[10][11]。目前，长距离周围神经损伤（大鼠中≥1厘米，人类中≥3厘米）的修复仍是一项重大临床挑战。自体神经移植仍是治疗长距离周围神经损伤的“金标准”[12]，但由于供体神经短缺以及供体与受体尺寸不匹配等缺陷，其临床应用受到限制[13][14]。因此，亟需寻找替代性治疗策略来取代自体神经移植，以修复周围神经损伤。

随着组织工程技术的快速发展，人工制造的神经引导导管成为治疗周围神经损伤的一种极具前景的新方法[15][16]。理想的人工神经引导导管能够模拟自体神经移植的生长微环境，为细胞的增殖、分化及轴突再生提供有利条件[17][18]。人工神经引导导管的仿生设计可从材料组成、拓扑结构及功能特性等多方面复制自体神经移植的特点[19][20][21]。已有研究表明，点状、截锥形、带槽、带脊以及阵列状等拓扑结构能够提升包括神经组织在内的多种组织的修复效果。例如，韩等人[25]开发了一种含有Fe3O4纳米颗粒的各向异性拓扑壳聚糖@球头蒿支架。他们的研究发现，这种各向异性拓扑支架结合外部静磁场下的非侵入式无线磁刺激，可协同调控施万细胞的形态变化、增殖及定向生长。体内实验进一步表明，在静磁场作用下，这种磁响应型壳聚糖@球头蒿神经导管能更有效地促进长距离坐骨神经损伤后的功能恢复与重建，其修复效果可与自体神经移植相当。此前，我们通过结合压电BaTiO3纳米颗粒与表面微拓扑结构，构建了一种仿生压电拓扑卵白蛋白/BaTiO3支架，能够实现原位非侵入式电刺激。实验结果表明，该支架可促进施万细胞的早期增殖与扩散，持续推动细胞伸长，同时压电信号与拓扑结构可协同调控背根神经节轴突的生长。刘等人[27]则设计了一种具有定向结构与导电特性的双功能仿生复合神经支架，用于修复周围神经损伤。其结构层为壳聚糖/聚己内酯定向纳米纤维膜，可增强细胞黏附并引导细胞定向生长；功能层为壳聚糖/海藻酸钠离子导电水凝胶，可增强内源性电场，促进细胞增殖与分化。这两层通过物理交联方式结合在一起。王等人[28]则通过同轴电纺技术制备了一种具有拓扑结构的导电纳米纤维支架，该支架由聚乳酸-羟基乙酸共聚物与多壁碳纳米管构成。他们在纳米纤维的芯层和壳层分别负载了神经生长因子与岩藻多糖。实验结果显示，这种导电纤维支架结合内源性电场的电刺激，可显著促进PC12细胞的分化及神经元轴突的生长。由此可见，通过整合仿生拓扑结构、生物活性基团及物理刺激功能，神经引导导管可通过多模式协同作用显著提升神经再生能力[23][29]。这类仿生设计能够模拟神经再生的理想微环境，从而在动物实验中实现接近自体神经移植的修复效果。

选择合适的基材对于构建具有各向异性拓扑结构的神经引导导管至关重要，因为材料特性直接影响拓扑结构的发挥作用以及神经修复的整体效果[30][31]。用于制造神经引导导管的材料应具备优异的生物相容性、可降解性、生物诱导性以及适宜的表面形态[32][33][34]。卵白蛋白是蛋清中含量最丰富的蛋白质，占蛋清总蛋白质的54%[35]。它具有明确的分子结构，包含羟基和羧基等功能基团[36]，由385个氨基酸组成，分子量为45千道尔顿[37]。由于其优异的生物相容性与可降解性，以及促进细胞黏附与增殖的能力[38][39]，卵白蛋白已被用作组织工程领域的支架材料[40][41]。人们通过浇铸、电纺及冷冻干燥等技术，制备出了具有薄膜、纤维及冻干支架等多种空间结构的卵白蛋白植入物。这些植入物具有良好的物理化学性质，能够促进血管生成，且与组织相容性良好，不会引发过度炎症反应或免疫反应。体外实验表明，卵白蛋白植入物可促进施万细胞的增殖与迁移；体内实验则显示，E5/70%组以及20千伏、20微升/分钟的照射组中的卵白蛋白植入物能够有效促进血管生成，减轻炎症反应，助力皮下神经损伤的修复。高等人[43]制备了经YIGSR功能化的拓扑卵白蛋白支架，发现这类支架能够显著促进施万细胞的增殖、迁移与延长，具有很大的应用潜力。因此，作为构建具有各向异性拓扑结构的神经引导导管的基材，卵白蛋白有望充分发挥其优异的生物相容性、加工性及生物活性，为拓扑引导的神经再生创造理想的微环境。鉴于卵白蛋白可通过电纺、冷冻干燥等技术轻松制成各种拓扑结构（如纤维膜和多孔支架），将其与生物活性物质结合，有望开发出兼具物理引导与生化诱导功能的新型神经支架。这类支架不仅能为细胞黏附与定向生长提供物理线索，还能通过持续释放生物活性信号，协同促进施万细胞的增殖与迁移以及轴突的定向延伸，从而进一步提升周围神经缺损的修复效果。

紫杉醇是一种具有抗癌活性的二萜类生物碱，可通过下调炎症因子的表达并减少促炎细胞因子的产生来发挥抗炎作用[44][45]。它还能通过增强或减弱特定的免疫反应来调节机体的免疫应答，因而具有一定的免疫调节作用[46]。此外，大量研究也表明，紫杉醇能够促进中枢神经系统中的轴突再生[47][48][49]。例如，李等人[50]开发了一种3D打印的多孔SilMA水凝胶支架，该支架载有pH/温度响应型紫杉醇纳米颗粒。在大鼠半切脊髓损伤的体内实验中，这种复合支架能够促进损伤部位的神经元再生，减少星形胶质细胞及纤维化瘢痕的形成，进而改善大鼠后肢的运动功能。朱等人[51]则制备了一种新型的弹性牛血清白蛋白水凝胶，用于释放紫杉醇与碱性成纤维细胞生长因子。实验结果表明，bFGF/PTX@BSA系统可通过促进轴突穿过胶质瘢痕生长并减少活性星形胶质细胞的分泌，显著促进脊髓损伤后大鼠的轴突修复及运动功能恢复。然而，在周围神经损伤修复领域，高浓度的紫杉醇会引发周围神经病变，而低浓度则有望对周围神经损伤的修复起到促进作用[52]。因此，精准控制紫杉醇的局部浓度，是将其从一种潜在的神经毒性药物转变为有效的周围神经损伤修复治疗药物的关键。鉴于低浓度紫杉醇在促进轴突再生及发挥抗炎作用方面的巨大潜力，将其加载到神经引导导管中，有望更好地调控周围神经损伤的微环境。

在本研究中，首先通过电纺技术制备了具有各向异性拓扑结构的卵白蛋白-T支架。随后，用多巴胺对这类支架进行表面修饰，得到多巴胺功能化的卵白蛋白支架。接着，将紫杉醇固定在上述支架上，最终成功制备出了经紫杉醇功能化的拓扑纤维支架。为了表征这类支架的物理化学性质，研究人员采用了多种分析方法，包括光学显微镜观察、扫描电子显微镜分析、亲水性测试、机械性能测试、降解性测试、药物释放分析以及傅里叶变换红外光谱分析。之后，通过体外细胞毒性试验、溶血率测定以及细胞增殖试验，评估了这类复合支架的生物安全性（见图1）。接着，研究了这类支架对RSC96细胞及背根神经节生长行为的影响，最后通过分子生物学实验探究了其背后的分子机制。本研究为新型神经再生移植材料的研发与设计提供了理论依据。

材料与方法：材料与方法的所有内容详见补充文件。

电纺电压的优化：采用滚筒作为接收装置，注射器流速设定为10微升/分钟。通过将电纺电压分别调整为15千伏和20千伏，制备了两组电纺纤维。在光学显微镜下观察了纤维的形态（见图S1A-D），纤维直径的统计分析结果见图S2A-D。对于含有15%或20%卵白蛋白以及1%聚氧乙烯的纺丝液，测得其平均纤维直径在1.0至5.5微米之间。

讨论：周围神经损伤的修复一直是临床实践和组织工程领域的重大难题，尤其是长段神经缺损的修复[53]。目前，周围神经损伤的临床治疗方法包括神经断端吻合、神经移植或植入神经引导导管以桥接神经断端[54]。迄今为止，研究人员已经探索了多种用于制造神经引导导管的材料，包括天然材料、合成材料以及复合材料[55][56]。

结论：本研究开发了一种具有拓扑结构的、经紫杉醇功能化的卵白蛋白支架，用于周围神经再生。该支架具有优良的物理化学性质，包括可控的降解性、更高的亲水性、更好的机械强度，以及长达96小时的持续紫杉醇释放能力；同时还具备优异的生物相容性（溶血率低于0.2%）和抗菌活性。低浓度紫杉醇（5–10微克/毫升）与这种各向异性拓扑结构的结合，进一步提升了其修复效果。

备注：本研究的所有材料与方法相关内容均见于补充文件。

作者贡献：明珠贾、乐乐王、远超赵负责数据整理及论文撰写；鑫金、霍云沈、玉清尚负责数据整理及实验工作；新月赵负责论文修订；凌燕邢、鸿芳吴、贵才李负责项目监督及资金申请。

CRediT作者贡献说明：玉清尚在软件应用、资源获取及方法设计方面做出贡献。沈火云：验证、方法论、研究。邢凌燕：验证、监督、项目管理。赵新月：软件、资源、研究。李桂才：写作——审稿与编辑、监督、资源、项目管理、资金筹措、概念设计。吴鸿芳：验证、监督、资源。贾明珠：写作——初稿撰写、方法论、研究、正式分析、数据整理。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（32571570）以及226高层次人才培训项目（第二层次，2022 II-276）的财政支持。