伴有垂体后叶受累的后天免疫性朗格汉斯细胞组织细胞增生症患儿外周血诊断前代谢物研究

《Metabolomics》：Pre-diagnostic metabolites in peripheral blood of Langerhans cell histiocytosis children with posterior pituitary involvement

　　

背景：朗格汉斯细胞组织细胞增生症（Langerhans cell histiocytosis，LCH）是一种炎症与肿瘤性疾病。儿童LCH患者血浆中的代谢物水平尚未被研究，且可能与疾病进展相关。目的：研究人员致力于寻找伴有垂体后叶受累（posterior pituitary involvement，PI）的儿童LCH血浆中新型的诊断前代谢物。方法：采用非靶向代谢组学测序检测儿童LCH血浆中的特异性及诊断前代谢物。纳入56例儿童LCH血浆样本与27例健康志愿者样本。将儿童LCH血浆样本分为三组：无PI或中枢神经系统风险（central nervous system-risk，CNS-risk）骨病变组（NPC组）、有CNS-risk骨病变但无PI组（CNS-risk组）及有PI组（PI组）。结果：与健康志愿者相比，N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid）、硫辛酰胺（lipoamide）、氧化型L-谷胱甘肽（L-Glutathione oxidized）及吲哚-3-丙酸（indole-3-propionic acids）是伴有PI的儿童LCH潜在的诊断前代谢物。伴有PI的儿童LCH血浆代谢物富集特定信号通路，包括花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）、铁死亡（ferroptosis）等。通过靶向代谢组学测序，研究人员验证特定代谢物存在于LCH患者的分层受累中，如N-乙酰神经氨酸与维生素A，其可能与血脑屏障通透性改变及LCH疾病进展相关。通过联合多组学分析，研究人员发现外周树突状细胞可能存在铁死亡现象，该现象受LCH患者血浆中分泌的骨桥蛋白（osteopontin）调控。结论：分析与鉴定儿童LCH血浆中的差异代谢物可能显著改善伴有垂体受累患儿的早期诊断与分层治疗。

该研究围绕朗格汉斯细胞组织细胞增生症（Langerhans cell histiocytosis，LCH）这一主要发生于儿童的罕见造血系统肿瘤性疾病展开。LCH由CD207⁺CD1a⁺朗格汉斯细胞克隆性增殖浸润导致器官病变与功能障碍，目前研究多聚焦于朗格汉斯细胞起源、临床诊断、治疗方案、突变基因检测及相关分子机制，已开展蛋白质组学、转录组学、全外显子测序、肽组学及单细胞转录组学研究，但针对LCH患者的代谢组学研究仍十分有限，仅见肺部呼出气冷凝物及脑脊液代谢物的少量报道，儿童LCH血浆代谢物水平与疾病进展的关系尚未明确。为探究LCH患儿分层受累血浆差异代谢物及促疾病加重的关键代谢物，研究人员开展本研究，旨在发现PI亚组患儿的诊断前代谢物，为早期诊断与分层治疗提供依据，相关成果发表于《Metabolomics》。

研究人员主要关键技术方法包括：构建样本队列，纳入56例经临床症状、磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）及病变组织CD1a⁺CD207⁺免疫组化染色确诊的儿童LCH患者，分为无垂体后叶受累（posterior pituitary involvement，PI）或无中枢神经系统风险（central nervous system-risk，CNS-risk）骨病变组（NPC组，19例）、有CNS-risk骨病变但无PI组（CNS-risk组，21例）、有PI组（PI组，16例），同期收集27例健康志愿者血浆为对照；采用非靶向代谢组学测序检测血浆代谢物，以变量重要性投影（VIP）≥1.2且P值≤0.05筛选差异代谢物，通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）等进行通路注释；采用靶向代谢组学验证N-乙酰神经氨酸、硫辛酰胺、氧化型L-谷胱甘肽、吲哚-3-丙酸及维生素A等代谢物水平；通过蛋白质印迹（Western blot）检测铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，xCT）、重链铁蛋白1（ferritin heavy chain 1，FTH1）及转铁蛋白受体（CD71），采用MitoTracker绿色荧光染色观察线粒体、BODIPY?581/591 C11检测脂质氧化以验证外周血树突状细胞铁死亡；联合单细胞转录组学与代谢组学分析通路交互。

研究结果如下。LCH患者具有特异性代谢物并参与不同信号通路：非靶向代谢组学显示，与健康对照组相比，LCH组显著上调代谢物包括3-磷酸甘油酸、N-乙酰神经氨酸、2-磷酸甘油酸、腺苷5’-二磷酸、甲羟戊酸、L-谷氨酸等，显著下调包括氧化型L-谷胱甘肽、维生素A、吲哚-3-丙酸、苯丙酮酸、N-乙酰天冬氨酸、N-乙酰甘氨酸、胆绿素、L-谷氨酰胺等，富集通路为精氨酸与脯氨酸代谢、花生四烯酸代谢、神经活性配体-受体相互作用、谷胱甘肽代谢、乙醛酸与二羧酸代谢等；主成分分析显示NPC、CNS-risk、PI三组代谢物存在显著差异。LCH合并CNS-risk患者具有特异性代谢物并参与不同信号通路：与NPC组相比，CNS-risk组上调前列腺素A3、甲羟戊酸、前列腺素B2、N-乙酰谷氨酸等，下调D-(-)-谷氨酰胺、5-羟色氨酸、DL-色氨酸、21-脱氧皮质醇等，富集类固醇激素生物合成、神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、初级胆汁酸生物合成及铁死亡等通路；与健康对照组相比，差异代谢物含N-乙酰神经氨酸、γ-谷氨酰谷氨酸、尿苷单磷酸、甲羟戊酸、谷氨酸、胱氨酸、维生素A等，富集前列腺癌、花生四烯酸代谢、库欣综合征、神经活性配体-受体相互作用等通路。LCH合并PI患者具有特异性血浆代谢物并参与不同信号通路：与健康对照组相比，PI组上调脱氧腺苷、L-焦谷氨酸、UDP-N-乙酰葡萄糖胺、谷氨酸等，下调L-谷氨酰胺、N-乙酰天冬氨酸等，富集AMPK、谷胱甘肽代谢、氨酰-tRNA生物合成及精氨酸与脯氨酸代谢等通路；潜在诊断前代谢物为N-乙酰神经氨酸、硫辛酰胺、氧化型L-谷胱甘肽及吲哚-3-丙酸，参与氨基糖与核苷酸糖代谢、谷胱甘肽代谢及神经系统保护；与CNS-risk组相比，PI组上调维生素A、辅酶Q2、半胱氨酰甘氨酸、前列腺素D2、前列腺素J2、前列腺素K1、19(R)-羟基前列腺素A2、19(R)-羟基前列腺素E2等，下调胱氨酸、L-胱氨酸、前列腺素G2、前列腺素A3、谷氨酸、甲羟戊酸等，富集胆汁分泌、花生四烯酸代谢及血清素能突触等通路；与NPC组相比，PI组上调L-胱氨酸、23-去甲胆酸、14,15-白三烯E4、N-乙酰葡萄糖胺、硫辛酰胺等，下调9,10-二羟十八碳二烯酸、γ-谷氨酰亮氨酸、前列腺素G2等，富集蛋白质消化吸收、胰岛素分泌、铁死亡、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、血小板代谢等通路。PI患儿外周血诊断前代谢物的验证：靶向代谢组学显示，LCH患儿血浆N-乙酰神经氨酸与维生素A水平显著高于健康志愿者，PI与NPC亚组吲哚-3-丙酸水平显著降低；血浆氧化型L-谷胱甘肽与硫辛酰胺水平在LCH患儿与健康志愿者间无差异；上述代谢物水平与LCH患儿预后及血浆或组织无细胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）BRAF^V600E突变无显著相关性；LCH患儿脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中N-乙酰神经氨酸、硫辛酰胺、氧化型L-谷胱甘肽、吲哚-3-丙酸及维生素A水平高于血浆。铁死亡信号通路参与LCH发病：联合外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）单细胞转录组与非靶向代谢组学显示，SPP1⁺细胞与cDC2/3细胞中MAPK信号通路与铁死亡通路富集，SPP1⁺细胞上调COL6A1、COL6A2、SPP1并参与PI3K-AKT通路，cDC2/3细胞上调MAPK相关基因MAP3K2、DUSP1、DUSP2、DUSP3、PLA2G4C、ARAF、FOS、DUSP10、DUSP6、RASA2、RPS6KA1、TRK；铁死亡相关基因在SPP1⁺细胞上调IFNGR2、PLA2G4C、BAX、CHMP5，在cDC2/3细胞上调RNF31、GLUD1、IFNGR2、CHMP1B、PLA2G4C、BAX、CHMP5；差异代谢物涉及MAPK与铁死亡通路的包括二十碳五烯酸、前列腺素K1、前列腺素D1、前列腺素J2、11-脱氧前列腺素F2β、前列腺素G2、前列腺素A3、甲羟戊酸、肾上腺酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、氧化型L-谷胱甘肽及谷氨酸；SPP1、DUSP1、PLA2G4C与环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）及前列腺素E2生成相关，参与花生四烯酸代谢及LCH进展。LCH患儿外周血树突状细胞发生铁死亡：LCH来源人树突状细胞（human dendritic cells，hDCs）转录组显示GPX4与FTH1显著下调，富集泛素介导的蛋白水解、帕金森病、p53信号通路、氧化磷酸化、长寿调节通路、亨廷顿病、铁死亡、柠檬酸循环、AMPK信号通路、阿尔茨海默病等；联合分析显示共同富集神经活性配体-受体相互作用、谷胱甘肽代谢、铁死亡、氧化磷酸化等，铁死亡通路中代谢物谷氨酸上调、花生四烯酸（arachidonic acid，AA）下调，基因TFR1、ALOX15、PCBP1/2、p53、STEAP3、SLC39A8/14上调，SLC3A11、GCL、GSS、VDAC2/3、LC3、ferritin、ATG5/7、SAT1下调；蛋白水平显示垂体受累LCH患者PBMCs中GPX4明显降低，LCH来源hDCs线粒体碎片化比例更高，C11 BODIPY免疫荧光显示脂质氧化水平升高，hDCs表面PD-L1显著上调；Thp-1诱导hDCs显示BRAF^V600E突变或分泌型骨桥蛋白（secreted osteopontin，sOPN）过表达调控hDCs铁死亡，表现为GPX4、SLC7A11、FTH1下调与CD71上调。

讨论部分总结：研究人员指出组间差异代谢物分析有助于LCH患者诊断前识别与分层治疗，联合hDCs转录组与血浆非靶向代谢组学显示MAPK与铁死亡为共同富集通路，PI与CNS-risk组关键差异代谢物包括前列腺素G2、前列腺素A3、维生素A、甲羟戊酸，分别参与花生四烯酸代谢、胆固醇合成及维生素消化吸收，花生四烯酸代谢关联脂质与蛋白调控、肿瘤进展及炎症促进，其为铁死亡执行关键组分；维生素A参与维生素消化吸收与肿瘤代谢，甲羟戊酸关联胆固醇合成与T细胞功能，胆固醇机制涉及血脑屏障破坏；既往研究显示PI患者脑脊液中骨桥蛋白高分泌，OPN可调控磷脂酰胆碱与胆固醇代谢交互，推测BRAF^V600E与sOPN可能通过调控体内hDCs铁死亡调节LCH进展；花生四烯酸可调节血管加压素释放，血管加压素降解与血总胆固醇相关，其与垂体后叶高信号强度相关，相关机制可为预防PI进展提供新靶点；PI患者血浆N-乙酰神经氨酸与硫辛酰胺显著上调，氧化型L-谷胱甘肽与吲哚-3-丙酸显著下调，后者关联铁死亡与神经再生修复；NPC组显著诊断代谢物为茶碱，参与肺保护、造血下调及气道炎症抑制；靶向验证显示LCH患儿脑脊液N-乙酰神经氨酸高于血浆，氧化型L-谷胱甘肽与硫辛酰胺因性质不稳定检测可能存在偏差，代谢物与预后及基因突变关联需更大样本探索；外源性代谢物如4-己基间苯二酚、γ-壬内酯、L-蛋氨酸、苯乳酸在PI患儿血浆升高，其对疾病进展影响待研究；组学突变与代谢物关联至关重要；树突状细胞铁死亡的分子机制、抗肿瘤能力及免疫反应仍需深入。

结论部分翻译：研究人员首次阐明与健康志愿者相比，儿童LCH血浆中存在特异性代谢物。儿童LCH血浆非靶向代谢组学测序显示，N-乙酰神经氨酸、硫辛酰胺、吲哚-3-丙酸与氧化型L-谷胱甘肽是伴有垂体受累的儿童LCH血浆中潜在的诊断前代谢物。血浆代谢组学谱型可为LCH发病时的分层诊断提供依据。诊断前代谢物的研究需进一步探索，也可能推动儿童LCH的分层治疗。