肌萎缩侧索硬化症、肌肉痉挛和TJ-68治疗的代谢组学分析

《Metabolomics》：Metabolomic analyses of amyotrophic lateral sclerosis, muscle cramps, and TJ-68 treatment

　　

摘要
引言
大多数肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）患者（一种致命性运动神经元疾病）会经历疼痛性肌肉痉挛。研究人员最近的日本汉方药TJ-68先导试验提示其在改善ALS患者肌肉痉挛方面的疗效。
目的
本研究分析血浆代谢组学变化，以揭示ALS肌肉痉挛的潜在机制及TJ-68的作用。
方法
在重复交叉试验中，从11名ALS参与者在5个时间点（基线、两个安慰剂阶段和两个TJ-68阶段）获得血浆。使用质谱法分析代谢物。应用线性混合效应模型（linear mixed-effects model）鉴定与肌肉痉挛相关的代谢物变化，确定TJ-68对代谢物的影响，并预测哪些参与者会对TJ-68有反应。
结果
较高的谷氨酰胺/谷氨酸（glutamine/glutamate）、精氨酸（arginine）和亮氨酸（leucine）水平与更严重的肌肉痉挛相关。TJ-68治疗增加了色氨酸（tryptophan）和乌头酸（aconitate）水平，但降低了血清素（serotonin）和乙酰肉碱（acetylcarnitine）水平。长链酰基肉碱（long-chain acylcarnitine，LC-Acyl-CN）水平与肌肉痉挛严重程度相关，且其水平在治疗后趋于下降。尿酸（uric acid，UA）、β-氨基异丁酸（beta-aminoisobutyric acid，BAIBA）、α-氨基己二酸（alpha-aminoadipic acid，AAAA）和乙酰胆碱（acetylcholine）成为TJ-68疗效的预测因子。
结论
本研究鉴定了ALS肌肉痉挛的代谢物谱以及TJ-68治疗后代谢物水平的变化。多个基线代谢物与TJ-68治疗后肌肉痉挛反应的预测相关。尿酸可能特别有用，因为其在标准检测中易于测量。本研究证实了代谢组学技术在未来ALS药物治疗和研究中的价值。

**肌萎缩侧索硬化症肌肉痉挛与TJ-68治疗的代谢组学解读**

**1. 研究背景与问题**

肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种致命性运动神经元疾病，以骨骼肌快速进展性瘫痪为特征。多数患者（57%–95%）会经历疼痛性肌肉痉挛，严重影响日常生活质量。尽管痉挛高发，但针对ALS肌肉痉挛的药物治疗十分有限。美西律（mexiletine）曾显示可减少痉挛，但因其心脏毒性风险（FDA黑框警告）而应用受限。日本汉方药TJ-68（Shakuyakukanzoto）在日本广泛用于治疗多种病因引起的肌肉痉挛。研究人员前期开展了一项随机、安慰剂对照、双盲、多周期交叉（N-of-1）试验，结果显示TJ-68安全，并提示可能改善ALS患者痉挛，但主要终点（痉挛影响日常活动）未达统计学显著性。因此，有必要通过代谢组学分析，深入理解ALS肌肉痉挛的潜在代谢机制以及TJ-68的作用机理，并识别可预测治疗反应的生物标志物。该研究发表于《Metabolomics》。

**2. 研究方法概述**

本研究样本来源于上述TJ-68临床试验中的11名ALS参与者（所有参与者符合每周至少5次肌肉痉挛的入组标准）。在重复交叉设计下，于基线、两个安慰剂期和两个TJ-68期共5个时间点采集EDTA抗凝血浆。采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）和气象色谱-质谱联用（GC-MS）对血浆代谢物进行定量分析，包括氨基酸、神经递质、酰基肉碱、三羧酸循环中间体、胆碱相关代谢物、肌酸/肌酐、尿酸等。所有代谢物定量采用稳定同位素稀释技术，并在线性混合效应模型框架下，评估代谢物变化与肌肉痉挛严重度（通过肌肉痉挛量表MCS总分、MCS问题2关于频率、MCS问题5关于日常活动影响）的关联，以及TJ-68对代谢物的影响，并预测TJ-68疗效的基线代谢物标志物。

**3. 研究结果**

**3.1 肌肉痉挛的预后价值**
线性混合效应模型分析发现，5种代谢物水平随总MCS增加而升高（p=0.029–0.046），包括谷氨酰胺/谷氨酸、精氨酸、亮氨酸等。具体而言，谷氨酸水平随MCS问题2（频率）增加而升高（p=0.045），而三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）水平随MCS问题2和MCS问题5（日常活动影响）增加而降低（p=0.049, p=0.040）。这些结果表明，特定氨基酸和TMAO与ALS肌肉痉挛严重程度密切相关。

**3.2 TJ-68治疗后的代谢物变化**
TJ-68给药后，色氨酸（p=0.023）和顺式乌头酸（cis-aconitate，p=0.034）水平显著升高，而血清素（p=0.041）和乙酰肉碱（p=0.040）水平显著降低。这些变化提示TJ-68可能通过影响色氨酸代谢、三羧酸循环及线粒体功能来发挥其作用。

**3.3 长链酰基肉碱对痉挛严重度及TJ-68反应的聚焦分析**
由于多个酰基肉碱与痉挛严重度相关，研究人员进一步聚焦长链酰基肉碱（LC-Acyl-CNs）。主成分分析和因子分析显示，LC-Acyl-CNs与总MCS显著正相关（因子分析第一因子p=0.044），即高水平LC-Acyl-CNs与更严重痉挛相关；而TJ-68治疗倾向于降低其水平（呈负相关趋势）。这提示线粒体功能障碍可能参与痉挛发生，且TJ-68可能改善线粒体能量代谢。

**3.4 TJ-68疗效的预测分析**
通过检测基线代谢物与TJ-68处理的交互效应，发现较低的β-氨基异丁酸（BAIBA，p=0.0004）和尿酸（UA，p=0.0001）水平显著预测更好的TJ-68疗效（降低总MCS）。此外，较低的α-氨基己二酸（AAAA，p=0.011）、α-氨基正丁酸（AANBA，p=0.0059）、乙酰胆碱（p=0.0076）和胆碱（p=0.049）水平，以及较高的羟脯氨酸（p=0.044）水平，也预测较好的治疗反应。基于MCS问题5的分析进一步确认，较低的UA、丙氨酸、脯氨酸、AAAA、AANBA水平，以及较高的谷氨酰胺水平，与TJ-68改善痉挛相关。这些代谢物可作为预测TJ-68个体疗效的潜在生物标志物。

**4. 讨论与结论**

讨论部分指出，本研究首次在ALS肌肉痉挛背景下鉴定出与痉挛严重度相关的代谢物变化。谷氨酸和谷氨酰胺的升高可能反映ALS中兴奋性毒性及肌肉代谢异常；精氨酸升高可能通过影响一氧化氮生成导致血管收缩和血流量减少，进而诱发痉挛。亮氨酸作为强效合成代谢氨基酸，其水平升高与痉挛严重度正相关，可能与肌肉蛋白代谢失衡有关。长链酰基肉碱水平升高提示线粒体功能障碍，这与ALS中已知的线粒体损伤一致。TJ-68治疗后色氨酸升高、血清素降低，可能通过调节运动神经元兴奋性和肌肉质量来减轻痉挛；乙酰肉碱降低和顺式乌头酸升高则支持TJ-68改善线粒体能量代谢的假设。在预测标志物方面，较低的BAIBA和UA水平显著预测TJ-68疗效，BAIBA作为肌因子可能反映肌肉萎缩状态，而UA作为抗氧化剂其水平较低可能提示疾病进展较晚，从而对TJ-68更敏感。此外，乙酰胆碱作为抗炎神经递质，其水平低可能有利于TJ-68发挥抗痉挛作用。研究也提到肠道菌群可能影响代谢谱，但未收集相关数据，需未来研究。局限性包括样本量小、未比较有无痉挛的患者、缺乏脂质组学分析等。

**结论**
本研究首次强调了少数伴有严重肌肉痉挛的ALS患者的代谢物变化，代表了ALS病例的一个亚组。此外，研究人员发现了TJ-68给药诱导的某些代谢物变化，TJ-68在日本常用于治疗肌肉痉挛。进一步，研究人员鉴定了可预测ALS肌肉痉挛中TJ-68反应的代谢物变化。研究人员坚信，ALS的代谢组学分析对于未来的临床试验和ALS疾病异质性评估可能非常有用。