基于CRISPR-Cas9和T7表达系统工具包的大肠杆菌Nissle 1917菌株的快速迭代代谢工程改造与高效蛋白质合成

《Systems Microbiology and Biomanufacturing》：CRISPR-Cas9 and T7 expression system toolkit-guided rapid iterative metabolic engineering and efficient protein synthesis in Escherichia coli Nissle 1917

　　

摘要

大肠杆菌 Nissle 1917（EcN）因其安全性高且具备强大的肠道定植能力，已成为代谢工程和活体生物治疗领域极具潜力的微生物载体。然而，长期以来，其基因操作一直受到编辑效率低、外源质粒不稳定以及缺乏稳定可控的表达系统等限制。在本研究中，我们基于一种经过优化的快速迭代型氨苄西林-氯霉素-链丝菌素-CRISPR–Cas9系统（ACS-CRISPR-Cas9），构建了一个适用于EcN的快速且可扩展的基因组工程平台。通过将简化的双sgRNA设计与抗生素循环驱动的ACS-CRISPR-Cas9迭代编辑流程相结合，并引入染色体整合型的T7表达系统，实现了高效且可诱导的基因表达。利用同源重组技术，可快速构建双sgRNA质粒，从而精确删除11个基因位点以及大小在17至45 kb之间的大型基因组片段，最大编辑效率可达97.9%。通过在11个不同的染色体位点上利用T7驱动的sfGFP整合，找到了三个高表达且中性的位点——wecB、nagAB和manXYZ，这些位点适合作为模块化途径整合的目标。在30天内，依次去除了12条竞争性代谢途径，同时将有9个-乙酰神经氨酸（NeuAc）生物合成模块整合到基因组中，最终在30天内得到了13种经过迭代工程的菌株。其中最优良的菌株EcNSA13在3升生物反应器中的NeuAc浓度可达35.78克/升，生产速率则为0.61克/升/小时。此外，该工具包还能在无需抗生素的情况下高效生产卵白蛋白（OVA），基于T7表达系统时，其浓度可达到202.91毫克/升。总体而言，ACS-CRISPR-Cas9平台与T7表达系统的结合显著提升了EcN的基因组编辑和模块化工程效率，为构建高性能的益生菌细胞工厂提供了有力手段，同时也为NeuAc及其他高价值生物产品的工业化生产奠定了技术基础。