NLR网络的动态调控揭示了松树-松针溃疡病菌互作过程中一个强烈诱导的NLR样基因

《Tree Genetics & Genomes》：Dynamic regulation of NLR networks reveals a strongly inducible NLR-like gene during the Pinus–Fusarium circinatum interaction

　　

核苷酸结合富亮氨酸重复（NLR）受体在效应子触发免疫中发挥核心作用，然而它们在针叶树中的多样性、调控和进化动力学仍知之甚少。研究人员调查了海岸松（Pinus pinaster）在病原体松针溃疡病菌（Fusarium circinatum）感染期间的NLR库，鉴定出193个在感染过程中表达的含NB-ARC的基因。TIR-NLRs（TNLs）是最大的亚家族，而辅助型RPW8-NLRs（RNLs）相对较少。大多数NLRs在转录水平上被抑制，但一部分表现出强烈的晚期诱导，揭示了四个不同的时间表达簇。系统发育分析显示主要NLR分支明显分离，但进化关系与转录模式之间没有对应关系，表明存在广泛的调控多样化。在诱导的基因中，有一个基因（PpRG）表现出异常强烈的上调。跨松属物种的表达谱显示，在F. circinatum感染后PpRG的诱导是保守的，而病斑严重程度与表达水平不相关。在海岸松中，PpRG特异性地响应茎部感染病原体（F. circinatum, Diplodia sapinea），但不响应叶部病原体、内生真菌、茉莉酸甲酯或干旱。功能和系统发育分析表明PpRG与NLR样蛋白相关，但其分类仍未解决。总之，研究结果揭示了海岸松中动态调控的NLR库，并确定PpRG是一个强烈诱导的、与茎部相关的基因，在与溃疡病菌互作过程中具有作为免疫信号相关候选生物标志物的潜在价值。

**论文解读：海岸松中NLR网络的动态调控及强烈诱导的NLR样基因PpRG的鉴定**

**研究背景**
植物通过模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI）两层先天免疫系统抵御病原体，其中核苷酸结合富亮氨酸重复（NLR）受体是ETI的核心组分。NLR蛋白通过识别病原体效应子激活下游信号，诱导防御基因表达和局部细胞死亡。尽管NLR在被子植物中已被广泛研究，但在针叶树中的多样性、调控和进化动态仍存在显著空白。针叶树基因组庞大、重复序列丰富，且NLR基因的注释和功能解析面临挑战。松树溃疡病（PPC）由松针溃疡病菌（Fusarium circinatum）引起，是全球松树最具破坏性的病害之一，尤其在伊比利亚半岛沿海地区对海岸松（Pinus pinaster）和辐射松（P. radiata）造成严重经济损失。不同松树物种对PPC的敏感性差异显著，但NLR基因在松树-病原菌互作中的表达动态、进化关系及候选抗性基因的鉴定仍不明确。因此，开展本研究旨在：（i）表征海岸松受F. circinatum侵染后候选抗病基因的表达模式和系统发育关系；（ii）确定一个高度上调的抗性基因（PpRG）在多种松树物种中的表达，以及其在海岸松中应对不同生物和非生物胁迫时的响应模式。该研究发表在《Tree Genetics》。

**主要技术方法**
研究人员利用先前生成的双RNA-seq数据集（海岸松受F. circinatum侵染后3、5、10天），筛选已注释为疾病相关基因的序列，通过InterProScan、EggNOG和NCBI保守结构域搜索鉴定含NB-ARC结构域的NLR候选基因，共获得193个高置信度NLR转录本。基于N末端结构域将NLR分为TIR-NB-LRR（TNLs）、CC-NB-LRR（CNLs）和RPW8-NB-LRR（RNLs）三个亚家族。通过差异表达分析、层次聚类（k=4）和卡方检验评估NLR亚家族与表达簇的关联。采用最大似然法构建系统发育树（JTT模型，1000次自举）。对PpRG进行RT-qPCR表达分析，检测其在四种松树物种（海岸松、辐射松、欧洲赤松、火炬松）受F. circinatum侵染后的表达，以及在海岸松中受多种茎部病原菌（F. circinatum、Diplodia sapinea）、叶部病原菌（Lecanosticta acicola、Botrytis cinerea）、内生真菌（Aureobasidium pullulans）、茉莉酸甲酯（MeJA）和干旱胁迫下的表达。样本来源：海岸松幼苗来自西班牙巴利亚多利德苗圃，欧洲赤松来自瓦尔赛因，辐射松和火炬松来自阿拉瓦苗圃；真菌菌株来自参考收藏。

**研究结果**
**Identification and characterization of NLR genes in P. pinaster**
通过结构域验证，在海岸松中鉴定出193个受F. circinatum侵染后差异表达的NLR转录本，其中TNLs（120个）占主导，CNLs（56个）和RNLs（15个）较少，另有2个未分类序列。大多数NLR基因被下调，仅39个上调。
**Expression profiling and clustering**
不同时间点的差异表达基因比较显示，大多数基因在10天时被检测到，表明以晚期转录响应为主。层次聚类将193个基因分为四个时间表达簇，包括早期诱导、瞬时激活和晚期诱导模式，其中大部分上调基因集中在晚期诱导簇。卡方检验显示NLR类型与簇归属无显著关联（p=0.065）。EDS1–PAD4–SAG101信号通路组分（多个EDS1、PAD4同源物及一个SAG101样序列）在5–10天时上调。
**Phylogenetic analysis of P. pinaster NLR proteins**
最大似然系统发育树显示主要NLR亚家族（TNL、CNL、RNL）清晰分离，TNLs最为多样。表达簇在系统发育分支上分布随机，表明进化关系与时间表达模式无对应关系，提示调控多样化。
**Expression of PpRG in multiple Pinus species**
PpRG功能注释表明其与含RPW8和NB-ARC结构域的疾病抗性蛋白相关，但缺乏完整经典NLR结构域，分类未定。四种松树物种接种F. circinatum后，30天时辐射松病斑最长（4.1±0.4 cm），海岸松中等（2.4±0.5 cm），火炬松和欧洲赤松病斑极小（<1 cm）。RT-qPCR显示PpRG在所有四种松树中均上调，海岸松诱导最强，辐射松和火炬松次之，欧洲赤松中等。病斑严重程度与PpRG表达水平不相关。
**Expression of PpRG under different biotic and abiotic stressors in P. pinaster**
在海岸松中，PpRG在茎组织中对茎部病原菌F. circinatum（上调倍数1.33×10⁴）、D. sapinea（1.16×10³）和F. proliferatum（69.5）表现出强烈诱导，但对内生真菌A. pullulans诱导不显著。叶部病原菌（L. acicola、B. cinerea）和干旱、MeJA处理均未显著改变PpRG表达。
**Phylogenetic analysis of PpRG homologs in conifers**
系统发育分析显示，PpRG与松科（Pinaceae）其他物种（如云杉、糖松）的NLR样蛋白聚为一支，支持其与NLR样蛋白的相关性，但无法明确归入特定NLR亚类。

**讨论与结论**
讨论部分综合了NLR网络在海岸松-松针溃疡病菌互作中的动态调控特征。研究发现，TNLs在海岸松NLR库中占主导，这与其它针叶树的NLR组成一致，而与被子植物中CNLs占优的模式不同。大多数NLR在感染期间被全局抑制，可能反映病原体效应子对宿主免疫的干扰，这与之前报道的敏感宿主中NLR通路延迟或减弱一致。然而，一小部分晚期诱导的NLR（簇4）在5–10天时强烈上调，表明一旦早期干扰减弱，防御反应被激活。系统发育与表达模式的不对应性表明调控多样化独立于保守结构域进化，这与针叶树中NLR基因的基因组聚集和重排促进快速多样化的观点一致。PpRG作为一个强烈诱导的基因，其表达在多种松树物种中保守，且特异性地响应茎部感染病原菌，不响应叶部病原菌、内生真菌或非生物胁迫，提示其可能参与茎部特异性免疫信号。尽管PpRG的功能分类尚不确定，但其与NLR样蛋白的序列相似性以及与EDS1-PAD4-SAG101通路组分的共表达，暗示其可能作为辅助型受体参与免疫信号放大。研究结论为：海岸松中NLR网络呈现动态调控，PpRG是一个强烈诱导的、与茎部防御相关的候选生物标志物，可用于监测免疫通路激活，并为未来抗性机制研究提供基础。