用于叶烧病诊断检测和甘蔗基因型评级的斑点印迹免疫测定

《Tropical Plant Pathology》：Dot blot immunoassay for diagnostic test of leaf scald disease and ranking of sugarcane genotypes

　　

由黄单胞菌（Xanthomonas albilineans）引起的叶烧病（leaf scald disease, LSD）和由李氏杆菌（Leifsonia xyli subsp. xyli）引起的宿根矮化病（ratoon stunting disease, RSD）是巴西甘蔗的两种主要病害。实验室诊断检测和抗性品种是控制这两种病害的有效策略。斑点印迹免疫测定（dot blot immunoassay, DBI）是适用于两者的诊断技术，这凸显了准确识别每种病害的必要性。此外，用于DBI提供可靠结果的适宜甘蔗植株年龄也需明确。而且，DBI基于其提供的细菌种群差异，具有对甘蔗基因型进行评级的潜力。因此，本研究旨在考察DBI区分LSD与RSD的实用性、确定适宜的甘蔗采样年龄，并建立基于DBI对甘蔗基因型进行LSD抗性评级的方案。对于第一个目标，对具有不同健康状态的甘蔗田块进行DBI检测；对于植株年龄，分别对8月龄、9月龄和10月龄甘蔗的染病汁液进行LSD的DBI检测；对于基因型评级，检测不同品种间病原菌的扩散和种群密度。试验采用完全随机区组设计，每个处理10次重复，每个重复为一盆一株，并重复进行。数据显示DBI具有稳健性，因为每种抗体都能将阴性样本与患病阳性样本区分开；DBI允许在同一份样本中同时检测两种病害，也能单独检测一种。10月龄甘蔗是适合进行LSD的DBI检测的年龄。在基因型对LSD的抗性方面，品种RB966928最易感，而品种RB867515最抗病。

**论文解读：基于斑点印迹免疫测定的甘蔗叶烧病诊断与基因型抗性评级研究**

**研究背景与问题**

甘蔗叶烧病（leaf scald disease, LSD）由白纹黄单胞菌（Xanthomonas albilineans）引起，宿根矮化病（ratoon stunting disease, RSD）由李氏杆菌（Leifsonia xyli subsp. xyli）引起，是巴西甘蔗种植业的两大系统性病害。这两种病害主要通过受污染的种茎传播，且无症状期长，田间难以目测区分，导致无病种茎的筛选极为困难。目前，实验室诊断检测和抗性品种是防控这两种病害最有效的策略。巴西广泛采用甘蔗段（billet）种植系统，该系统中斑点印迹免疫测定（dot blot immunoassay, DBI）因其成本效益而成为主要诊断技术。然而，LSD的常规诊断长期被忽视，且存在以下关键问题：第一，需要验证用于RSD和LSD的抗体特异性，避免交叉反应；第二，确定适宜的甘蔗采样年龄，以避免假阴性结果（此前RSD推荐的9月龄已出现假阴性，LSD尚无相关数据）；第三，DBI技术能否用于基于病原菌种群密度差异来评级甘蔗基因型的抗性水平，尚未得到探索。因此，本研究旨在验证DBI区分LSD与RSD的能力、确定最佳甘蔗年龄用于LSD诊断，并建立基于DBI的甘蔗基因型LSD抗性评级方案。

**研究内容与结论**

研究人员通过三个独立试验分别对应上述三个目标。首先，对具有不同健康状态的甘蔗田块进行DBI检测，验证抗体特异性及同时检测两种病害的能力；其次，以LSD易感品种RB966928为材料，选取经DBI确认为最低可检测浓度（10⁶ cfu/ml）的染病芽，种植后分别于8月龄、9月龄和10月龄提取汁液进行DBI检测，统计假阴性率；最后，对三个巴西主要甘蔗品种（RB867515、RB92579、RB966928）进行DBI检测，通过比较病原菌在节间的发生率（incidence）、种群密度沿茎秆的分布以及各节间种群密度百分比，评价品种抗性。试验采用完全随机区组设计，数据经卡方检验或Tukey检验分析。

主要结论：DBI技术能够有效区分LSD和RSD，且可同时检测单一或双重感染，无交叉反应；10月龄甘蔗是进行LSD的DBI诊断的最佳年龄，此时假阴性率为0，显著优于8月龄（95%假阴性）和9月龄（15%假阴性）；在三个品种中，RB966928最易感，RB867515最抗病，RB92579居中。该研究发表在《Tropical Plant Pathology》上，为巴西甘蔗产业提供了可靠的LSD诊断方案和品种抗性评级工具。

**关键技术与方法**

本研究主要采用以下关键技术：斑点印迹免疫测定（DBI），基于抗体-抗原特异性结合原理，通过将甘蔗汁液点样于硝酸纤维素膜，经一抗（兔抗X. albilineans IgG）和二抗（碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG）孵育，以蓝色斑点梯度表示病原菌种群密度（10⁶~10⁹ cfu/ml）。样本来源：试验一和试验二均采用田间采集的甘蔗汁液，试验二所用芽来自经过预筛选（确保初始接种体为10⁶ cfu/ml）的染病茎段，并在温室条件下种植；试验三所用品种取自巴西圣保罗州和马托格罗索州南部的第三茬宿根蔗田（7月龄），所有供试茎段均经DBI确认其基部节间种群密度为10⁸ cfu/ml（N2等级）。此外，试验中采用PCR（引物XAF1和XAR1）验证阴性对照。

**研究结果**

**LSD detection by DBI**
通过DBI对同一甘蔗田样本分别检测LSD和RSD，结果显示：99份样本中，39份LSD阳性（种群密度10⁷~10⁶ cfu/ml），且所有LSD阳性样本同时为RSD阳性，另有10份仅RSD阳性。在仅存在LSD的田块中，DBI检测到4份LSD阳性样本（10⁸~10⁶ cfu/ml），而所有99份样本RSD检测均为阴性。表明DBI的抗体特异性强，能准确区分两种病害，且可检测单一或复合感染。

**Effect of cane age on DBI analysis**
对8月龄、9月龄和10月龄甘蔗（均来自相同初始接种体浓度的染病芽）进行DBI检测，结果：8月龄甘蔗中仅1/20阳性（95%假阴性），9月龄甘蔗中17/20阳性（15%假阴性），10月龄甘蔗中20/20阳性（0%假阴性）。卡方检验显示假阴性率差异极显著（p=1.754e-10）。此外，DBI还揭示了种群密度随月龄增加的趋势：8月龄仅1份样本为10⁶ cfu/ml；9月龄出现10⁸（5份）、10⁷（9份）和10⁶（3份）cfu/ml；10月龄则主要为10⁸（8份）和10⁷（11份）cfu/ml。表明10月龄为LSD诊断的最佳采样年龄。

**Cultivar pathogen variation**
**Incidence of LSD in sugarcane internodes**：三个品种RB867515、RB92579和RB966928的节间发病率分别为78.69%、83.77%和92.54%。RB867515的发病率显著低于RB966928，表明前者更抗病；RB92579介于两者之间，无显著差异。
**Severity**：通过DBI分析茎秆基部、中部和顶部的种群密度，三个品种基部均被分类为N2（10⁸ cfu/ml），但RB966928的基部种群密度（8.71×10⁸ cfu/ml）显著高于RB867515（2.0×10⁸ cfu/ml）。此外，RB867515的顶部未检测到X. albilineans，而RB966928顶部有较高种群。各茎段均能区分品种抗性。
**Percentage of different population densities**：RB966928具有最高比例（51.06%）的感染节间含有最高种群密度（10⁹ cfu/ml），显著高于其他品种；RB867515则具有最高比例（39.19%）的感染节间含有最低种群密度（10⁶ cfu/ml），显著高于其他品种。因此，综合所有参数，RB966928为最易感品种，RB867515为最抗病品种。

**讨论与结论**

本研究改进了控制LSD的两项最有效措施——无病种茎和品种抗性。DBI技术能可靠区分LSD和RSD，且无交叉反应，这对流行病学意义重大，因为两种病害虽在传播途径上相似，但存在差异（如LSD可通过气传和替代寄主传播，热水处理温度不同）。鉴定出10月龄为最佳采样年龄，零假阴性结果对防止LSD在机械收割中通过刀片传播至关重要。在品种抗性方面，DBI基于病原菌在维管束中的种群密度，可高效区分品种反应，RB867515在所有指标上均表现出显著高于RB966928的抗性。该研究为巴西甘蔗产业提供了实用的LSD诊断方案和抗性评级工具，所涉及品种覆盖巴西主要种植区。

**结论翻译**：本研究表明，斑点印迹免疫测定（DBI）能够有效区分叶烧病（LSD）和宿根矮化病（RSD），且可检测单一或双重感染。10月龄甘蔗是进行LSD的DBI诊断的最适年龄，此时假阴性率为零。基于DBI检测的病原菌种群密度，三个巴西主要甘蔗品种中，RB966928最易感，RB867515最抗病，RB92579居中。DBI技术可用于甘蔗基因型对LSD抗性的评级。