使用16S rRNA序列短读长和长读长对犬肠道微生物组的比较分析揭示了工作流依赖性偏差

《Veterinary Research Communications》：A comparative analysis of gut microbiome in dogs using short- and long-reads of 16S rRNA sequences reveals workflow-dependent biases

　　

短读长Illumina测序16S rRNA基因高变区以及长读长Oxford Nanopore Technologies (ONT)全长16S基因测序越来越多地被用于分析微生物群落。然而，测序化学、读长和分类分配方法的差异引起了对微生物组谱可比性及其对生物学解释影响的担忧。研究人员分析了来自两组健康犬的粪便样本，8只年轻犬（32 < 年龄 < 59个月）和8只老年犬（年龄 > 109个月）。在命名法统一后，比较了从Illumina和ONT测序获得的分类相对丰度。使用Bland–Altman分析对log₂转换的相对丰度评估了工作流之间的一致性。尽管属水平的平均偏差很小（0.229），但一致性界限表明工作流之间互换性差。当限制于两种工作流均检测到的分类单元时，变异性降低但出现了更大的负偏差，表明丰度依赖性差异。通过在每个工作流内独立计算α和β多样性指标，评估了测序工作流对与宿主年龄相关的生物学相关信号的影响。α多样性在工作流之间存在差异，ONT产生的Shannon多样性和丰富度值高于Illumina。β多样性分析表明，仅在ONT中检测到显著的（p < 0.05）年龄相关群落组成变化，且解释方差和效应量存在差异。工作流比较揭示了门、科和属水平上的分类单元特异性差异，影响中等和高丰度分类单元。这些发现表明，测序工作流的选择影响微生物组谱分析和下游解释，强调了跨工作流比较时需要谨慎。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

肠道微生物组由宿主肠道内所有微生物组成，其组成变化与宿主健康密切相关。16S rRNA基因测序是表征微生物群落的常用方法，其中短读长Illumina测序（靶向16S rRNA基因高变区，如V3-V4区）和长读长Oxford Nanopore Technologies (ONT)测序（靶向全长16S rRNA基因）被广泛应用。然而，这两种工作流在测序化学、读长、引物设计、参考数据库及生物信息学流程上存在显著差异，导致不同工作流生成的微生物组谱的可比性受到质疑。先前研究主要关注分类分辨率（如Johnson et al. 2019），但对生态学指标（如α和β多样性）及生物学解释（如年龄相关差异）的影响关注不足。本研究旨在系统比较Illumina和ONT完整工作流在犬肠道微生物组分析中的差异，评估工作流选择对年龄相关信号检测的影响，并强调跨工作流比较需谨慎。

**研究内容与结论**

研究人员从16只健康比格犬（8只年轻犬，月龄32-59；8只老年犬，月龄109-146）的粪便样本中提取DNA，分别采用Illumina（V3-V4区，NovaSeq 6000测序，Greengenes数据库注释）和ONT（全长16S基因，MinION测序，NCBI数据库注释）两种工作流进行测序。通过命名法统一后，比较了门、科、属水平的分类相对丰度，并使用Bland-Altman分析、MA图、Wilcoxon检验评估工作流一致性。此外，独立计算每个工作流内的α多样性（Shannon和Chao1）和β多样性（Bray-Curtis距离，PERMANOVA）以评估年龄效应。研究发现：工作流间存在显著的系统性差异，尤其在低丰度分类单元检测和定量估计上；ONT检测到更高的α多样性和更显著的年龄相关β多样性信号；而Illumina在分类分配率上较低。结论表明，不同工作流生成的微生物组谱不可直接互换，工作流选择影响生物学解释，尤其在荟萃分析中需谨慎。该论文发表在《Veterinary Research Communications》。

**主要关键技术方法**

样本队列来源：16只健康雄性比格犬，分为年轻组（8只，32–59月龄）和老年组（8只，109–146月龄），粪便样本采集后使用Zymo Shield稳定DNA。DNA提取使用Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Miniprep? kit。Illumina工作流：扩增16S rRNA V3-V4区，使用Nextera XT文库制备，NovaSeq 6000平台双端250 bp测序，QIIME2/DADA2处理，Greengenes数据库（2024.10）注释。ONT工作流：使用16S Barcoding Kit 1–24扩增全长16S rRNA基因（引物27F/1492R），MinION平台R9.4.1 Flow Cell测序，EPI2ME平台（Kraken2算法）基于NCBI数据库（2026年1月）注释。统计方法：Bland-Altman分析（log₂转换相对丰度）、MA图、Wilcoxon检验（FDR校正）、α多样性（Shannon/Chao1，Wilcoxon秩和检验）、β多样性（Bray-Curtis距离，PERMANOVA，999次置换）。

**研究结果**

**Differences between Illumina and ONT microbiome profiling workflows**
通过比较分类分配率，ONT在科和属水平的分配率显著高于Illumina（ONT中位分配率96.9%和97.3%，Illumina为92.3%和72.1%，FDR < 0.01）。Bland-Altman分析显示，完整数据集（560个属-样本配对）的属水平平均偏差小（0.229 log₂单位），但一致性界限宽（-13.05至13.51），表明工作流间互换性差。当仅分析两种工作流均检测到的分类单元时，变异性降低但负偏差增大（平均偏差-0.987），提示丰度依赖性差异。MA图揭示了多个分类单元的系统性偏差：例如，Peptacetobacter、Romboutsia和Clostridioides在ONT中相对富集，而Unclassified_Fusobacteriaceae、Unclassified_Lachnospiraceae和Collinsella在Illumina中相对富集（FDR < 0.05）。门水平上，Bacillota、Fusobacteriota和Bacteroidota在ONT中估计更高，Actinobacteriota在Illumina中更高；科水平上，Enterobacteriaceae、Enterococcaceae在ONT中更高，Coriobacteriaceae在Illumina中更高。

**Age-associated microbiome variation within Illumina and ONT workflows**
α多样性分析显示，ONT数据产生的Shannon多样性和Chao1丰富度均显著高于Illumina（p < 0.05），且两工作流间Chao1估计值呈强正相关（Spearman ρ=0.738，p=0.001），而Shannon多样性仅中度相关且不显著（ρ=0.432，p=0.094）。年龄组内比较表明，仅ONT工作流中Chao1指数在老年和年轻犬间显著差异（p=0.003）。β多样性分析（Bray-Curtis PCoA）显示，两工作流均能部分分离年龄组，但PERMANOVA仅在ONT中检测到年龄的显著效应（门：R2=0.204，p=0.038；科：R2=0.154，p=0.020；属：R2=0.139，p=0.029），而Illumina中无显著效应。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，工作流间差异主要源于低丰度分类单元的存在/缺失不一致，以及定量估计的系统性偏差。即使在两种工作流均检测到的分类单元中，丰度估计仍存在差异，且随分类分辨率提高而更明显。α多样性指标对工作流选择敏感，直接比较不同研究间的多样性值可能导致误导。β多样性分析中，ONT更敏感地检测到年龄相关信号，但两种工作流均可恢复大致的生物学模式。研究局限性包括样本量小、无法区分各因素的单独贡献、未使用系统发育β多样性指标，以及保守过滤可能低估分歧。研究结论强调：不同工作流生成的微生物组谱不可直接互换，尤其在低分类水平；工作流感知式解释在跨研究比较和荟萃分析中至关重要。年龄相关模式在两种工作流中均可检测到，但定量表示因工作流而异，因此跨工作流数据需谨慎解释。