猪毛发中嗜铬粒蛋白A和S100A12蛋白的测定：检测验证、不同生产阶段的变化及与其他毛发生物标志物的比较

《Veterinary Research Communications》：Chromogranin A and S100A12 protein measurement in hair of pigs: assay validation, changes across different production stages and comparison with other hair biomarkers

　　

毛发已成为用于回顾性评估猪健康状况的非侵入性基质。虽然毛发皮质醇和硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S）已被用作下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的生物标志物，但交感-肾上腺髓质（SAM）轴和先天免疫的指标，如嗜铬粒蛋白A（CgA）和S100A12，尚未在毛发中测定。本研究旨在（1）评估CgA和S100A12是否能在猪毛发中检测到，以及（2）分析其在生长猪关键生产阶段（对20头猪进行纵向采样，包括哺乳期、保育期和育肥期）浓度的可能纵向变化，并将其值与皮质醇和DHEA-S进行比较。对于CgA和S100A12的测量，使用了AlphaLisa技术，而皮质醇和DHEA-S则使用自动化学发光法进行定量。验证结果显示，CgA和S100A12在毛发提取物中具有免疫反应可检测性，具有高精密度（CVs<15%）、系列样品稀释后的线性度（R²=0.99）以及充分的回收率（94.1-109.1%）。在育肥猪的一个生产周期中，CgA浓度在整个周期中逐渐增加，在育肥期末具有较高的值（p=0.022），而S100A12浓度在保育期末显著达到峰值（p=0.0004）。皮质醇在保育期末最高，而DHEA-S在育肥期末显著增加（p=0.0002）。本报告提供了CgA和S100A12在猪毛发提取物中具有免疫反应可检测性的证据，为这些分析物在该基质中的潜在评估开辟了新窗口。

论文解读文章

**研究背景与问题**

在猪的福利与健康评估中，非侵入性采样方法日益受到重视。毛发作为一种可回顾性记录长期生理变化的基质，已被用于检测皮质醇和硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S）等下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的生物标志物。然而，反映交感-肾上腺髓质（SAM）轴活性的嗜铬粒蛋白A（CgA）以及参与先天免疫反应的S100A12蛋白，尚未在猪毛发中测定。现有研究主要基于唾液或血液样本，这些样本易受急性应激和采样操作影响，难以反映长期累积的生理状态。猪的生产周期（哺乳期、保育期、育肥期）伴随显著的营养、社会和环境变化，需要神经内分泌、免疫和代谢系统的持续适应，为研究长期生理动态提供了理想模型。因此，研究人员旨在评估CgA和S100A12在猪毛发中的可检测性，分析其在不同生产阶段的变化，并与已建立的毛发生物标志物皮质醇和DHEA-S进行比较。

**研究内容与结论**

研究人员对20头大白猪（来自5窝，每窝4头）进行纵向采样，在哺乳期末（4周龄）、保育期末（11周龄）和育肥期末（25周龄）收集毛发样本。通过AlphaLisa技术检测CgA和S100A12，使用自动化学发光法测定皮质醇和DHEA-S。结果表明：CgA和S100A12在猪毛发提取物中具有免疫反应可检测性，验证实验显示高精密度（变异系数CVs<15%）、线性度（R²=0.99）和回收率（94.1-109.1%）。在生产周期中，CgA浓度从哺乳期到育肥期逐渐升高，育肥期末显著高于哺乳期（p=0.022）；S100A12浓度在保育期末达到峰值，显著高于育肥期（p=0.0004）；皮质醇在保育期末最高，而DHEA-S在育肥期末显著增加（p=0.0002）。各毛发生物标志物之间未发现显著相关性，且性别对浓度无显著影响。该研究发表于《Veterinary Research Communications》。

**关键技术方法**

研究人员从西班牙穆尔西亚大学兽医教学农场选取20头大白猪（11雌9雄），在哺乳期、保育期和育肥期末收集颈背部毛发，剪取靠近皮肤1 cm段以反映采样前3-4周的累积情况。采用甲醇提取法处理毛发样本，经研磨、孵育、离心和蒸发后复溶于磷酸盐缓冲液（PBS）。CgA和S100A12使用AlphaLisa技术（基于直接竞争法和双夹心法）测定，皮质醇和DHEA-S使用自动化学发光免疫分析仪（Immulite 2000）定量。通过变异系数、稀释线性度、回收率、检测限（LOD）和定量下限（LLOQ）进行方法学验证。

**研究结果**

**1. 分析验证**
通过内分析和批间变异系数评估精密度，CgA和S100A12的CVs均<15%。系列稀释后线性回归R²=0.99，回收率分别为94.1-99.4%和95.8-109.1%，表明方法在毛发提取物中具有可靠的免疫反应可检测性。

**2. 性别影响**
混合效应模型显示，性别对CgA、S100A12、皮质醇和DHEA-S浓度均无显著主效应，且性别与生产阶段无交互作用，因此合并性别数据进行分析。

**3. 生产阶段变化**
- **S100A12**：浓度在保育期末显著高于育肥期末（平均差177.9 pg/mg，p=0.0004）。
- **CgA**：浓度从哺乳期到保育期显著增加（平均差85.5 pg/mg，p=0.034），并在育肥期维持高水平（哺乳期与育肥期对比平均差177.7 pg/mg，p=0.022）。
- **皮质醇**：哺乳期浓度显著高于保育期和育肥期（平均差分别为33.4和36.7 pg/mg，p<0.01）。
- **DHEA-S**：育肥期浓度显著高于哺乳期和保育期（平均差分别为262.8和312.2 pg/mg，p<0.01）。
- **皮质醇/DHEA-S比值**：哺乳期显著高于育肥期（p=0.0002），呈现递减趋势。

**4. 相关性分析**
唾液与毛发CgA浓度在各时间点均无显著相关（r=0.22-0.27，p>0.05）。各毛发生物标志物之间亦无显著相关（Spearman's r范围-0.24至0.14，p>0.05）。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究首次报道了CgA和S100A12在猪毛发中的免疫反应可检测性，并扩展了皮质醇和DHEA-S的测量方法。CgA的升高可能反映育肥期累积性交感激活，而S100A12在保育期的峰值可能与断奶后先天免疫系统的基础激活相关。皮质醇的高值和DHEA-S的低值在哺乳期体现了高代谢需求，而育肥期DHEA-S的升高则提示肾上腺成熟和生长相关的代偿机制。未发现相关性表明这些生物标志物可能反映不同的生理路径。研究局限性包括：甲醇提取可能影响蛋白质结构，回收实验仅反映液体提取物中的干扰，缺乏对提取效率的真实评估；样本量较小且来自单一农场，结果需谨慎解读。

结论翻译：本报告表明，CgA和S100A12在猪毛发提取物中具有免疫反应可检测性。毛发采样对动物造成的干扰最小，这是优于传统采样方法的明显优势。然而，由于样本量相对较小、单一农场设计以及当前关于提取效率和蛋白质掺入机制的不确定性，本报告应被视为初步的概念验证研究。这些因素可能限制结果的普遍适用性。进一步研究应阐明这些方面，并评估测定这些分析物是否能提供关于交感激活和免疫状态的补充信息，从而更全面地理解猪生产阶段相关的生理变化。