《Zoomorphology》：Post-embryonic development of the lung and mucous glands associated with intertidal adaptations in the air-breathing sea slug Peronia setoensis (Gastropoda: Onchidiidae)
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陆生化（terrestrialization）是动物进化中的重大转变之一，而适应潮间带栖息地被认为是该过程的中间阶段。腹足类动物多次向陆地殖民，典型方式是通过壳获得抗干燥能力以及通过肺进行有氧呼吸。值得注意的是，石磺科（Onchidiidae）中无壳的空气呼吸
陆生化（terrestrialization）是动物进化中的重大转变之一，而适应潮间带栖息地被认为是该过程的中间阶段。腹足类动物多次向陆地殖民，典型方式是通过壳获得抗干燥能力以及通过肺进行有氧呼吸。值得注意的是，石磺科（Onchidiidae）中无壳的空气呼吸海蛞蝓属（Peronia）栖息于岩石潮间带，并在低潮期间主动在暴露的基质上移动，表明其具备支持陆地活动的适应性。在此，研究人员检查了Peronia sp.中可能与潮间带适应相关的两个性状的胚后发育：用于空气呼吸的肺（lung）以及与干燥耐受性相关的粘液腺（mucous glands）。首先利用分子和形态学数据鉴定研究物种为P. setoensis，并记录其胚胎发生。通过对从孵化幼体到成体的发育阶段进行组织学观察，发现孵化幼体缺乏分化的粘液腺，但有一个未成熟的肺样结构从后内脏区域向体表延伸，提示早期呼吸孔（pneumostome）形成。随后，在生长过程中，粘液腺丰度和肺内部嵴（internal lung ridge）复杂度逐步增加。最后，成体拥有沿外套膜边缘和背表面密集分布的粘液腺，以及一个具有大量内部嵴的发达后肺。这些结果表明，在P. setoensis中，肺结构和粘液腺的胚后发育与周期性气生暴露期间陆地活动能力的增强密切相关。肺和粘液腺的逐步发育，可能对应于空气呼吸能力和干燥耐受性的逐渐获得，反映了潮间带适应的发育途径。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
陆生化（terrestrialization）是动物进化史上的重大转变之一，适应潮间带栖息地常被视为该过程的中间阶段。腹足类动物多次独立登陆，通常演化出壳以抵抗干燥，以及肺（lung）进行有氧呼吸。然而，石磺科（Onchidiidae）的无壳空气呼吸海蛞蝓属（Peronia）栖息于岩石潮间带，在低潮时主动暴露于日光下活动，表现出对陆地活动的特殊适应。当前研究存在两个关键问题：一是潮间带适应性的关键结构——肺和粘液腺（mucous glands）在个体发育中何时形成、如何逐步成熟；二是这些结构的发育是否与行为差异（如小型个体躲在藻类下、大型个体暴露活动）相关。此前虽有个别研究报道了石磺科物种的肺形态发生或粘液腺存在，但缺乏从孵化到成体全程的组织学系统观察。因此，本研究旨在阐明Peronia属物种中肺和粘液腺的胚后发育时序与模式，以揭示适应周期性气生暴露的发育基础。
**研究内容与结论**
研究人员以日本三浦半岛采集的Peronia sp.为对象，首先通过线粒体COI（细胞色素c氧化酶亚基I）基因序列和外部形态鉴定物种为P. setoensis，并详细记录其胚胎发生过程。随后对孵化幼体、幼体和成体三个发育阶段进行组织学（periodic acid-Schiff, PAS染色）观察，系统比较肺和粘液腺的结构变化。研究发现：孵化幼体缺乏分化粘液腺，但存在未成熟肺样结构及早期呼吸孔（pneumostome）形成；随着生长，粘液腺丰度和肺内部嵴（internal lung ridge）复杂度逐步增加；成体拥有沿外套膜边缘和背表面密集分布的粘液腺，以及具有大量内部嵴的发达后肺。结论表明，肺和粘液腺的胚后发育与P. setoensis在周期性气生暴露中陆地活动能力的增强密切相关，其逐步发育可能反映了潮间带适应的发育途径。该论文发表在《Zoomorphology》。
**关键技术方法**
本研究采用以下关键技术方法：1）分子鉴定：提取足部组织DNA，扩增线粒体COI基因片段，构建最大似然（ML）系统发育树，结合外部形态（树状次生鳃、黑色眼柄、橙黄色足）确认物种为P. setoensis，样本来源为日本神奈川县三浦半岛荒井滨（Araihama）；2）胚胎发育观察：在实验室内利用循环水槽模拟潮汐周期，收集自然产卵的卵块，在25°C、12h光暗周期下孵化，使用复合显微镜及Z-stack图像重建技术记录从单细胞期到孵化后的形态变化；3）组织学切片：对野外采集的成体（外套膜长12–48 mm，n=69）和幼体（1.1–7.3 mm，n=22）以及从孵化幼体（发育天数22–106天）制备石蜡切片（8–10 μm）或树脂切片（5 μm），采用PAS染色法显示多糖（粘液主要成分），并以苏木精复染，观察肺腔、内部嵴、粘液腺分布及心脏、肾脏等结构。
**研究结果**
**1. 物种鉴定**
通过COI序列构建的系统发育树显示，所有采集个体与参考序列P. setoensis聚为一支（自展支持率99%），结合外部形态特征（树状次生鳃、黑色眼柄、橙黄色足），确认所有样本均为P. setoensis。该结果将P. setoensis的已知分布范围从纪伊半岛扩展至房总半岛以南。
**2. 胚胎发生与孵化幼体形态**
胚胎发生遵循腹足类典型螺旋卵裂，经历1细胞至原肠胚阶段。产卵后第8天（DAO）发育为具纤毛面盘（velum）的担轮幼虫；第16天左右在卵囊内开始变态，面盘消失，足形成；第22天孵化出壳（壳长约350 μm），孵化后约7天（29 DAO）蜕壳，体呈蛞蝓状，背侧出现外套膜结构。孵化幼体无外部呼吸孔、背侧乳突或背鳃，但可见心脏搏动。
**3. 孵化幼体内部结构**
29 DAO（7 DAH，外套膜长0.334 mm）的PAS染色切片显示外套膜和足部均无PAS阳性区域，后部有未分化组织团块，推测为肺和肾原基（primordium）。43 DAO（21 DAH，0.425 mm）时仍无PAS阳性结构，但后部组织向外突出形成呼吸孔，并与连续结构相连，提示肺正在发育。106 DAO（84 DAH，0.850 mm）时足部出现少量PAS阳性斑点，外套膜中仍无，后部呼吸孔更明显，一个深染膜围绕内脏腔开始形成隔离空间，提示肺腔早期分化。
**4. 幼体内部结构**
外套膜长2.4 mm的幼体，PAS阳性小斑点沿外套膜腹缘分布，背侧表皮下方有少量较大斑点。呼吸孔开放，肺、心脏、肾脏与内脏腔分离，肺从呼吸孔向左、右分支并向前延伸，但内部嵴和向前延伸有限。外套膜长7.3 mm的幼体，大量PAS阳性斑点沿腹缘分布，背侧表皮下方也有较大斑点。肺从呼吸孔向两侧分支形成U形结构，内部出现大量嵴，左侧肺向前渐细，右侧肺前端毗邻围心腔。肾脏与肺组织呈交错排列。
**5. 成体内部结构**
成体外套膜PAS染色显示，腹缘密布大小不等的PAS阳性斑点（小粘液腺），背侧表皮下方可见较大PAS阳性斑点（大粘液腺）。肺位于与内脏腔分离的体腔中，内表面具有大量嵴，从后部呼吸孔向前左、右两侧延伸形成复杂的U形结构，与肾脏共同构成肾-肺复合体（renal–pulmonary complex）。围心腔内可见由后心房和前心室组成的心脏。
**讨论与结论**
**讨论部分**总结了P. setoensis的分布范围更新（扩展至三浦半岛），并指出其发育模式介于卵囊内发育与浮游发育之间：胚胎在卵囊内开始变态但尚未完成时即孵化，孵化后约一周蜕壳完成变态。这种中间发育模式可能兼具两者优势——既保留一定扩散能力，又产生较大个头幼体。此外，研究人员提出肺和粘液腺的逐步发育模型：孵化阶段形成肺原基，幼体阶段肺逐渐分化并出现内部嵴，同时粘液腺开始出现并增多。背侧大粘液腺可能主要减少水分蒸发，腹缘小粘液腺则辅助在暴露岩石上运动时的润滑。肺内部嵴的增加还提高了气体交换效率，以补偿体表面积/体积比随生长下降的局限（square-cube law）。研究还指出，P. setoensis在野外利用不同微生境：小型个体躲藏于绿藻下，大型个体暴露于岩石表面活动，这与肺和粘液腺的发育程度一致。最后，讨论强调未来需结合行为观察、耗氧量测量及微生境选择研究，以及跨物种比较粘液成分和肺结构，以深入理解潮间带适应的生化和进化机制。
**研究结论**（翻译自原文Conclusion部分）
这些结果表明，在P. setoensis中，肺结构和粘液腺的胚后发育与周期性气生暴露期间陆地活动能力的增强密切相关。肺和粘液腺的逐步发育，可能对应于空气呼吸能力和干燥耐受性的逐渐获得，反映了潮间带适应的发育途径。
