破坏巨噬细胞迁移抑制因子信号诱导人M2巨噬细胞中主要的肿瘤相关巨噬细胞表型

《Molecular Biomedicine》：Disruption of macrophage migration inhibitory factor signaling induces major tumor-associated macrophage phenotypes in human M2 macrophages

　　

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）主要来源于浸润的单核细胞，但指导其分化的机制仍不清楚。在此，研究人员表明，人巨噬细胞在M2样转化过程中依赖自分泌的巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）信号来抑制p53。破坏该通路导致p53以及出乎意料的核受体NR4A1的激活，诱导出一种类似衰老的状态，该状态类似于在多种癌症中观察到的白细胞介素（interleukin, IL）-1β?和IL-4诱导蛋白1（IL-4 induced 1, IL4I1）? TAM亚群。这些TAM样巨噬细胞展现出由NR4A1驱动的转录程序，类似于IL-1β? TAMs中由肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF）和环氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）依赖性花生四烯酸（arachidonic acid, AA）代谢物前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）联合作用所诱导的程序。它们还上调了AA选择性酰基辅酶A合成酶ACSL4，该酶促进细胞存活，并抑制IL-1β的释放，尽管IL1B表达升高。这一效应是通过诱导IL4I1? TAM标志物CD38介导的，CD38驱动了IL-10的产生。机制上，ACSL4维持了干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）的稳态功能。ACSL4的缺失导致大量巨噬细胞死亡，并将STING从稳态调节因子转变为IL-1细胞因子释放的驱动因子。最后，研究人员表明，CDK4/6抑制剂abemaciclib通过脱靶抑制ACSL4，将TAM样巨噬细胞重新极化为更炎症性的表型。Abemaciclib通过调节胞外域脱落，增加TNF同时减少其天然拮抗剂TNF受体II的释放，从而增强炎症信号。总之，这些发现阐明了scRNA-seq定义的TAM表型的潜在机制，确定了ACSL4作为潜在治疗靶点，并揭示了abemaciclib如何促进癌症患者的炎症反应。

**论文解读：MIF信号破坏诱导人M2巨噬细胞向肿瘤相关巨噬细胞表型转化的机制研究**

**研究背景与问题**
巨噬细胞在炎症消退过程中从促炎性M1状态向抗炎性M2状态转化，但这一过程若失调则会促进慢性炎症。单细胞RNA测序（scRNA-seq）在大多数人类肿瘤中识别出具有慢性炎症和免疫抑制表型的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群，其中IL-1β? TAM和IL4I1? TAM是致病性炎症和免疫抑制的关键驱动因素。TAM可能来源于单核细胞，但其分化机制尚不明确。肿瘤抑制因子p53可破坏M2极化过程，并激活细胞死亡通路；为完成M2极化，巨噬细胞需防止p53过度积累，否则需借助强效存活通路，如进入衰老状态。衰老细胞脂质代谢显著改变，花生四烯酸（AA）可促进衰老，而AA选择性酰基辅酶A合成酶ACSL4参与线粒体完整性维持和铁死亡调控。核受体NR4A1（Nur77）调控M2极化，并在IL-1β?巨噬细胞中与TNF和PGE2协同驱动基因表达。本研究旨在阐明MIF信号在TAM分化中的作用，并探索ACSL4及CDK4/6抑制剂abemaciclib的潜在干预机制。

**研究所用关键技术方法**
研究人员从健康供者白细胞层（buffy coats）经密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs），再通过CD14磁珠阳性分选获得单核细胞，经M-CSF诱导分化为M2巨噬细胞。采用MIF中和抗体或nutlin-3a（MDM2抑制剂）激活p53，结合NanoString nCounter平台进行基因表达分析（Host Response Panel），流式细胞术检测蛋白表达，ELISA和细胞因子微珠阵列（CBA）定量分泌组。使用多种抑制剂：PRGL493（ACSL4抑制剂）、H-151和C53（STING抑制剂）、DIM-C-pPhOH（NR4A1拮抗剂）、epacadostat（IDO1抑制剂）、celecoxib（COX-2抑制剂）、78c（CD38抑制剂）等，以及AA-BSA复合物进行外源性AA加载实验。

**研究结果**
**1. 人巨噬细胞在M2表型转化过程中利用自分泌MIF信号维持低p53水平**
通过流式细胞术检测到M-CSF诱导的M2巨噬细胞表达MIF受体组分CD74和CXCR4；单核细胞自发分泌MIF，M-CSF增强该过程。MIF中和或nutlin-3a处理显著上调p53，而联合抗CD74和CXCR4拮抗剂协同激活p53，证实CD74/CXCR4是主要MIF受体。p53积累导致MIF受体下调，形成前馈抑制。

**2. MIF耗竭促进已知TAM表型的产生**
NanoString分析显示，MIF耗竭与nutlin-3a处理诱导的基因表达谱高度重叠（前50个基因中80%重叠），包括IDO1、IL1B、CCL20等，特征与IL-1β? TAM（IL1B、TNF、PTGS2）和IL4I1? TAM（CD38、LAMP3）高度相似。p53high TAM样巨噬细胞还上调IFN刺激基因和衰老相关分泌表型（SASP）因子。流式细胞术验证了表面标志物CD38、CD40、IDO1、CD25等上调，且IDO1抑制形成自我维持环路。功能实验显示，p53high TAM样巨噬细胞显著抑制CD14缺失PBMCs中IL-2/IL-18诱导的IFN-γ产生，证实其免疫抑制能力。

**3. cGAS-STING通路在人TAM样巨噬细胞中增强**
差异基因表达分析表明，线粒体p53促进抗炎程序，包括STING上调。cGAS-STING通路组分（cGAS、STING、下游效应分子）在MIF耗竭或nutlin-3a处理后显著上调。STING抑制剂H-151（共价拮抗剂）降低CCL20和VEGF分泌，但增加IL-1β产生；C53（质子通道抑制剂）选择性抑制CCL20和VEGF，不升高IL-1β。STING抑制诱导细胞死亡，提示STING在TAM样巨噬细胞中发挥保护性稳态功能。环孢素A（CsA）抑制亲环蛋白D介导的线粒体通透性转换孔（mPTP）开放，选择性诱导p53high TAM样巨噬细胞死亡，且产生IL-1α和IL-1β，表明mPTP开放是生存必需。

**4. TAM样巨噬细胞激活ACSL4以避免细胞死亡并阻止STING依赖性IL-1细胞因子释放**
ACSL4在TAM样巨噬细胞中上调，依赖线粒体p53。ACSL4抑制剂PRGL493诱导p53high TAM样巨噬细胞大量死亡，并触发IL-1α和IL-1β释放，后者依赖caspase-1和STING受体及质子通道活性。ACSL4抑制也降低IL-10和VEGF分泌，并阻断CD38上调。STING抑制剂未能阻止死亡，反而增加死亡率，表明ACSL4维持STING的稳态功能。

**5. ACSL4驱动TAM样巨噬细胞中CD38的表达**
PRGL493剂量依赖性地阻断CD38上调。STING的受体功能（H-151敏感）也参与CD38诱导，而质子通道抑制剂C53反而增加CD38表达。CD38抑制剂78c降低IL-10和VEGF分泌，且联合IL-10中和可诱导IL-1β释放，揭示CD38-IL-10轴抑制IL-1β。

**6. Abemaciclib靶向人TAM样巨噬细胞中的ACSL4-CD38通路**
CDK4/6抑制剂abemaciclib（ABE）降低nutlin-3a诱导的ACSL4、CD38、IDO1和CD163表达，并重组分泌谱：降低IL-10、VEGF、CXCL10，增加CCL20、TNF，减少可溶性TNFR II。ABE通过调节ADAM17介导的胞外域脱落，差异化调控TNF和TNFR II释放，转向促炎状态。ABE也增强IL-1β释放，并诱导细胞死亡。AA加载实验证实，外源性AA通过ACSL4介导的AA-CoA形成，诱导CD38和IL-6上调，依赖线粒体p53和STING受体活性，且可被ABE和PRGL493阻断。

**7. NR4A1参与TAM样巨噬细胞发育**
NR4A1在MIF耗竭或nutlin-3a处理后上调。NR4A1激动剂DIM-C-pPhOCH3诱导的基因表达谱与抗MIF和nutlin-3a处理有显著重叠，包括IL1B、TNF、PTGS2、ACSL4等。NR4A1拮抗剂DIM-C-pPhOH剂量依赖性地抑制nutlin-3a诱导的CXCL8、CCL20、VEGF、IL-6、IL-10分泌及CD38表达，并降低AA加载诱导的CD38和IL-6。

**总结与讨论**
本研究采用反向转化方法，阐明scRNA-seq定义的TAM亚群（IL-1β?和IL4I1?）的潜在机制。研究人员发现，M2分化过程中p53的积累和线粒体转位，协同NR4A1激活，驱动巨噬细胞进入衰老样TAM表型。ACSL4通过维持STING的稳态功能，促进细胞存活并抑制IL-1β释放，而COX-2产生PGE2协同NR4A1驱动TP基因签名。ACSL4缺失导致STING转变为促炎驱动因子。Abemaciclib通过脱靶抑制ACSL4，重新极化TAM样巨噬细胞向炎症表型，解释了其间接抗肿瘤免疫效应。结论：这些发现阐明了scRNA-seq定义的TAM表型的机制，确定ACSL4为潜在治疗靶点，并揭示了abemaciclib如何促进癌症患者的炎症反应。