利用RGB12和白色分析化学整合原理的多用途色谱方法用于二甲双胍、达格列净和格列美脲的同步稳定性研究

《Future Journal of Pharmaceutical Sciences》：Multipurpose chromatographic method for concurrent stability study of metformin, dapagliflozin, and glimepiride using integrated principles of RGB12 and white analytical chemistry

　　

背景：本研究开发了一种新型多用途色谱方法，用于盐酸二甲双胍（MH）、达格列净丙二醇一水合物（DPM）和格列美脲（GP）的同步稳定性分析。该方法解决了对一种稳定性指示HPTLC方法的需求，用于同时评估这些药物在联合剂型中的含量，这对治疗2型糖尿病至关重要。目的：本研究旨在开发并验证一种稳定性指示HPTLC方法，用于药物剂型中MH、DPM和GP的同时定量。研究人员旨在各种应力条件下进行强制降解研究，并使用AQbD方法优化HPTLC方法开发。方法：本研究采用了一种通过分析质量源于设计（AQbD）方法优化的高效薄层色谱（HPTLC）方法。该方法利用诸如Plackett-Burman设计和最小运行分辨率IV设计等统计工具来优化关键参数。它包括在各种应力条件下的强制降解研究，以及根据ICH Q2（R2）指南进行的方法验证。该方法被应用于分析含有MH、DPM和GP的市售制剂。结果：所开发的HPTLC方法在同时测定MH、DPM和GP时表现出高准确性、精密度和灵敏度。该方法在各种应力条件下有效分离了降解产物与母体化合物，证明了其稳定性指示特性。它显示出良好的线性、低LOD和LOQ值以及高回收率。该方法成功分析了市售制剂，结果与标示量高度一致。此外，在环境可持续性和操作效率方面，该方法优于先前发表的RP-HPLC方法。结论：所开发的HPTLC方法为MH、DPM和GP的同步稳定性分析提供了一个稳健、环境友好且高效的工具。在分析质量、可持续性和操作效率方面，该方法优于现有方法。

**论文解读：基于RGB12与白色分析化学整合原理的多用途色谱方法用于二甲双胍、达格列净和格列美脲的同步稳定性研究**

**研究背景**

近年来，药物分析范式已从单纯关注分析性能，转向更全面的框架，同时兼顾分析质量、环境可持续性和操作效率。这一整合哲学体现在白色分析化学（WAC）中，旨在调和绿色分析化学（GAC）的原则与分析方法性能的功能性要求。WAC框架通过三个互补维度——红色（分析质量属性，如范围、灵敏度、准确度和精密度）、绿色（环境可持续性，包括试剂毒性、废物产生和能耗）和蓝色（操作实用性，涵盖成本、时间、简便性和用户友好性）——评估分析方法，并共同形式化为RGB12评估模型。同时，分析质量源于设计（AQbD）方法作为一种系统、基于科学的开发框架应运而生，利用风险评估、实验设计（DoE）和响应面建模来建立具有明确定义控制策略的稳健方法可操作设计区域（MODR）。WAC原则与AQbD方法的整合，使得能够合理开发在操作生命周期内不仅对环境负责，而且具有可证明的稳健性、可靠性和预期用途适用性的分析程序。

药物稳定性是药品质量的基本属性，直接影响药品的安全性、有效性和有效期。因此，稳定性指示分析方法在药物开发、质量控制和法规遵从中是必不可少的工具。2型糖尿病（T2DM）是全球最紧迫的健康挑战之一。盐酸二甲双胍（MH）是T2DM的一线药物，达格列净丙二醇一水合物（DPM）和格列美脲（GP）常与二甲双胍联合使用，以实现互补作用机制。尽管这种三联药物组合具有临床意义，但文献综述显示，尚无稳定性指示HPTLC方法用于同时测定其联合剂型中的MH、DPM和GP。现有RP-HPLC方法存在有机溶剂消耗量大、依赖有毒溶剂、无法同时分离所有三种药物及其降解产物等局限性。在此背景下，HPTLC技术因其可同时处理多个样品、溶剂消耗量低、环境相容性好、操作成本低等优势，被确定为最适合、最可持续且稳健的分析平台。

**研究内容与结论**

本研究针对上述问题，开发并优化了一种新颖的稳定性指示高效薄层色谱（HPTLC）方法，用于同时定量分析盐酸二甲双胍（MH）、达格列净丙二醇一水合物（DPM）和格列美脲（GP）。研究人员采用分析质量源于设计（AQbD）方法，结合Plackett-Burman筛选设计和最小运行分辨率IV因子设计，系统优化了关键色谱参数，确立了明确的方法可操作设计区域（MODR）和稳健的控制策略。该方法根据ICH Q2（R2）指南进行了全面验证，并在酸性、碱性、中性、氧化、热和光解等六种应力条件下进行了强制降解研究，以证明其稳定性指示能力。还应用该方法对市售固定剂量复方制剂进行了分析，并使用RGB12、AGREE、Mo-GAPI和BAGI评估工具，与已发表的RP-HPLC方法进行了分析、环境和操作性能的综合比较。

**结论**：所开发的HPTLC方法为同时测定MH、DPM和GP提供了一个稳健、环保且高效的工具。该方法首次报道了针对这一三元药物系统的稳定性指示HPTLC方法。通过在六种应力条件下成功分离所有降解产物，证明了其卓越的特异性。在三种药物中，MH表现出最高的整体稳定性，而DPM对热和碱解应力最为敏感，GP在酸性条件下降解最严重。该方法在分析质量、环境可持续性和操作效率方面均优于现有RP-HPLC方法，获得了81.66分的整体白度评分，被评为“卓越白色和绿色”。

**研究意义**：这项工作为这一具有临床重要性的抗糖尿病三联药物组合的质量控制和稳定性测试提供了一个稳健、环保且经分析验证的平台，具有应用于监管申报和药品质量保证程序的潜力。

**关键技术方法**

1. **分析质量源于设计（AQbD）方法**：利用Plackett-Burman筛选设计从11个初始分析程序变量（APVs）中识别关键变量，随后应用最小运行分辨率IV因子设计（17次运行+3个中心点）响应面优化，以建立关键响应变量（CRVs）与关键APVs之间的定量关系，并定义方法可操作设计区域（MODR）和控制策略。

2. **高效薄层色谱（HPTLC）技术**：在硅胶60 F₂₅₄铝基板上，以甲苯-乙酸乙酯-氨水-5% w/v醋酸铵甲醇溶液（5:3:2:0.5, v/v/v/v）为优化流动相，在236 nm波长下进行吸收/反射模式薄层扫描，实现MH、DPM和GP的同时分离与定量。

3. **强制降解研究**：根据ICH Q1A(R2)指南，对药物混合物分别进行酸性（2 N HCl, 80 °C, 3 h）、碱性（1 N NaOH, 60 °C, 3 h）、中性（水, 80 °C, 3 h）、氧化（3% H₂O₂, 室温, 3 h）、热（80 °C, 3 h）和光解（日光, 5 h）六种应力条件下的降解，以评估方法的稳定性指示能力。

4. **整合的RGB12、AGREE、Mo-GAPI和BAGI评估工具**：用于系统评估方法的红色（分析质量）、绿色（环境可持续性）、蓝色（操作实用性）和白度（整体性能）轮廓，并与已发表的RP-HPLC方法进行基准比较。

**研究结果**

**分析目标概况（ATP）和关键分析程序变量（APVs）**：通过AQbD方法，确定了关键响应变量（CRVs）为MH与DPM的分离度（> 1.5）、DPM与GP的分离度（> 1.5）以及三种药物的比移值（Rf，0.2-0.8），并设定了误差不超过5%的目标。

**初步试验和分析风险评估**：通过Plackett-Burman设计筛选，发现检测波长、带宽、改性剂体积和甲苯与醋酸铵的比例是显著影响分离度和Rf值的关键APVs。

**响应面分析和方法的优化**：通过最小运行分辨率IV因子设计的响应面分析，确认甲苯与醋酸铵的比例（APV-A）对响应值影响最大，改性剂体积（APV-B）与APV-A的交互作用显著。优化后的条件为：甲苯:醋酸铵比例5:3 (v/v)，改性剂体积0.55 mL。

**方法可操作设计区域（MODR）和控制策略**：通过重叠等高线图确定了黄色阴影的MODR，其中甲苯:醋酸铵比例可在5:3至4:4 (v/v)之间变动，氨水体积可在0.1至1.0 mL之间调整，仍能获得满意的色谱结果。优化条件使MH、DPM和GP的Rf值分别为0.20、0.61和0.73，分离度分别为4.23和1.58。

**方法验证结果**：根据ICH Q2（R2）指南验证，该方法在MH（20,000-100,000 ng/带）、DPM（400-2000 ng/带）和GP（80-400 ng/带）范围内线性良好。所有药物的精密度（%RSD < 2%）和准确度（回收率98-102%）均符合要求。MH、DPM、GP的检测限（LOD）分别为674.34、13.56和12.54 ng/带，定量限（LOQ）分别为2043.46、41.09和37.99 ng/带。稳健性良好，溶液稳定。

**多组合MH、DPM和GP的稳定性指示测定**：该方法成功应用于市售制剂的分析，MH、DPM和GP的含量分别为标示量的100.25%、98.3%和97.5%，且辅料无干扰。

**强制降解样品分析**：强制降解研究表明，GP在酸性条件下降解最严重（28.42%），DPM在热（22.74%）和碱性（18.91%）条件下降解显著，MH在光解条件下降解最明显（8.09%）。所有降解产物均能与母体药物峰良好分离，证明了该方法卓越的稳定性指示能力。

**讨论部分总结**

**RGB12原则用于红度、绿度、蓝度和白度轮廓评估**：使用RGB12、AGREE、BAGI和Mo-GAPI工具，将所提出的HPTLC方法与已发表的RP-HPLC方法进行了比较评估。

- **红度轮廓评估**：所提出的HPTLC方法因采用AQbD方法、具备稳定性指示能力、单一色谱条件适用于所有三种药物，因此在适用范围方面更优，获得85分（RP-HPLC为80分）。
- **绿度轮廓评估**：HPTLC方法使用毒性较低的溶剂（乙酸乙酯、甲醇），产生的有机废物更少（<10 mL/样品 vs. >100 mL/样品），因此环境可持续性更佳，获得70分（RP-HPLC为60分）。
- **蓝度轮廓评估**：HPTLC方法成本更低、分析时间更短、操作更简便、对操作人员要求更低，且能同时分析多个样品，因此操作实用性更强，获得90分（RP-HPLC为80分）。
- **白度轮廓评估**：基于RGB12评分平均值，HPTLC方法的整体白度轮廓评分为81.66分，被评为“卓越白色和绿色”；而RP-HPLC方法为73.33分，被评为“足够白色和绿色”。

**MH、DPM和GP的稳定性比较**：综合比较显示，MH是最稳定的API，DPM的降解谱最广（热、碱、中性、光解），是稳定性最关键的组分，而GP的降解主要发生在酸性条件下，具有高度选择性。

**研究结论翻译**

本研究成功地展示了开发、优化和验证一种新颖的多用途HPTLC方法，用于同时评估固定剂量复方剂型中盐酸二甲双胍（MH）、达格列净丙二醇一水合物（DPM）和格列美脲（GP）的稳定性——这是首次报道针对该三元药物系统的方法。本工作的新颖性在于整合应用了分析质量源于设计（AQbD）原则，采用Plackett-Burman筛选和最小运行分辨率IV因子设计，建立了一个具有验证控制策略的明确定义的方法可操作设计区域（MODR）。该方法根据ICH Q2（R2）指南进行了严格验证，并表现出卓越的特异性，通过其在酸性、碱性、中性、氧化、热和光解条件下，从母体分析物中色谱分离所有六种应力诱导的降解产物的能力得以证实。在三种分析物中，MH在所有应力条件下表现出最高的整体稳定性，而DPM表现出对热应力（22.74%降解）和碱性水解（18.91%）的显著敏感性，GP在酸性条件下表现出最高的降解率（28.42%）。在所评估的市售制剂中，Daxigo GM 2显示出与所有三种活性药物成分标示量最接近的一致性，反映了更优的产品稳定性。通过整合应用RGB12、AGREE、Mo-GAPI和BAGI评估工具，所提出的HPTLC方法相对于先前报道的RP-HPLC方法在生态和操作上的优越性得到了全面确立，其整体白度轮廓评分为81.66分——被归类为“卓越白色和绿色”。这项工作为这一具有临床重要意义的抗糖尿病三联药物组合的质量控制和稳定性测试提供了一个稳健、对环境负责且经分析验证的平台，具有应用于监管申报和药品质量保证程序的潜力。