《Investigational New Drugs》：The novel agent VP79s synergistically enhances venetoclax activity in multiple myeloma cells
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尽管新疗法取得了进展，多发性骨髓瘤（MM）仍然无法治愈，大多数患者复发或对治疗产生耐药性，这表明需要新的治疗策略。研究人员先前鉴定出VP79s，一种新型胍基化合物，具有强大的抗骨髓瘤活性，靶向失调的IL-6/JAK/STAT信号通路。本研究旨在进一步评估VP7
尽管新疗法取得了进展，多发性骨髓瘤（MM）仍然无法治愈，大多数患者复发或对治疗产生耐药性，这表明需要新的治疗策略。研究人员先前鉴定出VP79s，一种新型胍基化合物，具有强大的抗骨髓瘤活性，靶向失调的IL-6/JAK/STAT信号通路。本研究旨在进一步评估VP79s的转化潜力，通过检测其是否与BH3模拟物venetoclax协同作用，并探索这一效应的潜在机制。VP79s和venetoclax单独或联合使用的促凋亡效应通过annexin V/碘化丙啶（PI）染色后进行流式细胞术分析进行评估。蛋白免疫印迹（Western blotting）用于评估Bcl-2家族关键促凋亡和抗凋亡成员的表达水平。BH3分析（BH3 profiling）评估了细胞对Bim结构域肽的凋亡预备状态。NCI-H929和MM1.S细胞经VP79s/venetoclax联合处理后，凋亡显著协同增强，这与抗凋亡蛋白Mcl-1的减少及促凋亡蛋白Bim S的同时增加相关。在U266B1细胞中未观察到协同效应，可能因为这些细胞对venetoclax表现出相对耐药性，并且在Bim肽刺激下凋亡预备水平较低。重要的是，VP79s与venetoclax联合处理NCI-H929细胞能克服骨髓基质细胞（BMSC）诱导的耐药性。初步研究结果还表明，联合处理在离体骨髓瘤患者样本中诱导了更强的活性降低，同时对健康供体淋巴细胞的细胞毒性极小。这些发现支持VP79s与venetoclax联合作为MM潜在治疗策略的进一步临床前研究。
**研究背景与问题**
多发性骨髓瘤（MM）是一种以骨髓中浆细胞克隆性增殖为特征的血液系统恶性肿瘤，约占所有血液肿瘤的10%。尽管近年蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物及单克隆抗体等新疗法使5年生存率提升至50%以上，但MM仍无法治愈，多数患者最终复发或对治疗产生耐药性。骨髓微环境（BMM）通过骨髓基质细胞（BMSC）与骨髓瘤细胞的相互作用，激活NF-κB、JAK/STAT等通路，分泌IL-6等促存活细胞因子，上调抗凋亡Bcl-2家族成员（如Mcl-1），促进耐药。Bcl-2家族蛋白通过调控线粒体外膜通透性（MOMP）决定细胞命运。BH3模拟物如venetoclax（ABT-199）特异性靶向抗凋亡Bcl-2，已在部分t(11;14)或del 17q MM患者中取得疗效，但Mcl-1或Bcl-xl的上调可导致耐药。研究人员前期发现新型胍基化合物VP79s通过抑制IL-6/JAK/STAT3通路，降低Mcl-1表达，在MM细胞系和离体患者样本中具有抗骨髓瘤活性，并与硼替佐米协同。鉴于MM细胞高度依赖Mcl-1，而venetoclax靶向Bcl-2，本研究假设双重靶向这两种抗凋亡蛋白可产生协同抗骨髓瘤效应，旨在评估VP79s与venetoclax在骨髓瘤细胞中的联合疗效及机制。
**研究方法**
本研究采用以下关键技术方法：1）细胞凋亡分析：通过annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测细胞死亡。2）蛋白表达分析：利用蛋白免疫印迹（Western blotting）检测Bcl-2家族关键蛋白（Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xl、Bim、活化型Bax/Bak、cleaved Caspase-3）的表达水平。3）BH3分析：以Bim结构域肽处理细胞，评估线粒体细胞色素C释放，反映凋亡预备状态。4）联合用药分析：采用Chou-Talalay中效原理，通过CompuSyn软件计算联合指数（CI）。5）共培养模型：将骨髓瘤细胞NCI-H929与人骨髓基质细胞系HS-5共培养，模拟BMM诱导的耐药性。6）离体患者样本：从St James’s Hospital（都柏林）获取骨髓瘤患者骨髓穿刺物，经密度梯度离心和CD138阳性选择分离骨髓瘤细胞，并与HS-5共培养后检测联合处理效果。健康供体外周血单核细胞（PBMC）用于评估细胞毒性。
**研究结果**
**VP79s协同增强venetoclax诱导的NCI-H929和MM1.S细胞死亡，并克服基质细胞介导的耐药性**
在NCI-H929细胞中，VP79s单独处理诱导约25%细胞死亡，venetoclax单独处理效果微弱，而联合处理显著增强凋亡。CompuSyn分析显示所有联合处理CI值<1，证实协同作用。蛋白免疫印迹表明联合处理显著增加cleaved Caspase-3表达。与HS-5共培养未减弱联合处理诱导的细胞死亡，而硼替佐米的效应被显著降低，提示该联合能克服BMM诱导的耐药。在MM1.S细胞中同样观察到协同增强凋亡和cleaved Caspase-3增加。
**U266B1细胞中未观察到协同效应**
在U266B1细胞中，联合处理未显著增强细胞死亡。BH3分析显示，U266B1细胞对Bim肽诱导的细胞色素C释放反应较弱，IC50值高于NCI-H929和MM1.S细胞，表明其凋亡预备水平较低，可能解释了对venetoclax的相对耐药性。
**协同作用与抗凋亡Mcl-1降低及促凋亡Bim S增加相关**
在MM1.S和NCI-H929细胞中，联合处理显著降低抗凋亡Mcl-1（而非Bcl-xl或Bcl-2）表达，同时显著增加促凋亡Bim S（短型异构体）表达。在U266B1细胞中，联合处理部分恢复了Mcl-1表达，且Bim表达未上调，与缺乏协同效应一致。此外，联合处理在MM1.S和NCI-H929细胞中诱导了高分子量（~45 kDa）构象活化型Bax免疫反应物种，提示Bax寡聚化，而Bak无明显变化，表明涉及Bax介导的凋亡信号。
**VP79s/venetoclax联合处理在离体骨髓瘤患者样本中选择性诱导细胞死亡，对健康供体淋巴细胞毒性极小**
在健康供体PBMC及B细胞、T细胞、NK细胞亚群中，单独或联合处理均未引起显著细胞毒性。在3例骨髓瘤患者CD138?细胞中（与HS-5共培养），联合处理使细胞活力降低约50%，显著优于单药处理，且效应与t(11;14)状态无关。
**讨论与结论**
讨论部分指出，VP79s通过抑制IL-6/JAK/STAT3通路间接下调Mcl-1，与直接Mcl-1抑制剂或CDK9抑制剂相比，可能具有机制优势，可同时干扰其他促存活通路。联合处理中Mcl-1下调与Bim S上调共同促进了协同凋亡。U266B1细胞的耐药性与其较低的凋亡预备状态及Mcl-1部分恢复有关，提示BH3分析可作为预测venetoclax反应的生物标志物。该联合能克服基质细胞介导的耐药，并在离体患者样本中显示选择性毒性。研究局限性包括：样本量小、缺乏Mcl-1/Bim敲除或过表达机制验证、无体内药效/毒性数据。结论：本研究证明了Bcl-2抑制剂venetoclax与新型胍基化合物VP79s在选定骨髓瘤细胞系中的强效抗骨髓瘤活性及协同作用，该协同可能与抑制关键促存活因子Mcl-1和增强促凋亡Bim S有关。初步发现表明，该联合在患者来源骨髓瘤细胞中诱导选择性细胞毒性，并克服骨髓基质细胞诱导的耐药性，支持进一步临床前研究。
