Rhipicephalus linnaei 蜱细胞培养物中的嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）：检测、抗生素耐药性及多位点序列分型（multi-locus sequence typing）

《Antonie van Leeuwenhoek》：Stenotrophomonas maltophilia in a Rhipicephalus linnaei tick cell culture: detection, antibiotic resistance and multi-locus sequence typing

　　

蜱类携带多样的微生物群落，但其中机会性和环境相关的细菌仍知之甚少。研究人员在尝试建立经表面消毒的犬蜱 Rhipicephalus linnaei 胚胎原代细胞培养物时，检测到嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），这是一种多重耐药的环境细菌和新现机会性病原体。吉姆萨（Giemsa）染色涂片的显微镜检查显示大量胞外杆状细菌与退化的蜱细胞密切相关，无细胞内感染证据。基于 16S 和 23S rRNA 基因测序的分子鉴定确认该菌为 S. maltophilia，抗生素药敏试验显示其对阿莫西林?克拉维酸（amoxicillin-clavulanic acid）、亚胺培南（imipenem）、头孢西丁（cefoxitin）和呋喃妥因（nitrofurantoin）耐药，但对美罗培南（meropenem）敏感。多位点序列分型（multi-locus sequence typing, MLST）将分离株鉴定为序列型 948（ST948），其为 ST408 的单一位点变异体和 ST144 的双位点变异体，二者均是来自不同地理来源的环境和临床 S. maltophilia 菌株的代表。这些发现首次提供了嗜麦芽窄食单胞菌出现在蜱源细胞培养系统中的证据，并强调在解释蜱微生物组和基于细胞培养的研究时需要考虑机会性细菌，特别是涉及兽医相关蜱种的研究。

该研究发表于《Antonie van Leeuwenhoek》。目前蜱类作为专性吸血外寄生虫及全球公认的多种人类、家畜和野生动物病原体媒介已被广泛认知，除病毒、细菌和原虫外，蜱还携带包括专性内共生菌及短暂或环境获得细菌在内的多样微生物组，这些微生物可影响蜱的生理、发育和媒介能力。然而相较于病原性和共生细菌，蜱中机会性或环境相关细菌的生态与持续存在仍知之甚少。嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）是一种常见于土壤、水、植物和多种动物宿主的好氧非发酵γ?变形菌纲（Gammaproteobacterium），虽以人机会性细菌著称，也常于环境样本中检出且具有多重固有耐药性，其在节肢动物包括蜱中有报道但其生态作用不明确。过去二十年蜱细胞培养被建立为在受控条件下探索蜱相关微生物的有力工具，包括蜱原代细胞培养可将来自蜱组织或匀浆的细菌剂直接扩增，涵盖常规微生物学方法难以分离的那些，但通过蜱细胞培养分离到机会性环境细菌的报道仍罕见。本研究主要目标是在马来西亚持续开发蜱细胞资源工作的一部分，从 Rhipicephalus linnaei 建立蜱原代细胞培养，期间意外从蜱组织匀浆中分离到 S. maltophilia，因该菌在含抗生素的培养基中持续存在，研究人员随后用多位点序列分型（multi?locus sequence typing, MLST）进行分子表征并评估其抗生素耐药谱，以阐明分离株的身份与可能来源，并证明蜱原代细胞培养作为检测蜱相关偶然或机会性细菌平台的效用。

研究人员用到的主要关键技术方法如下：样本为2022年12月采自马来西亚霹雳州犬体的饱血雌性 Rhipicephalus linnaei，经形态学鉴定后表面消毒并产卵，取可见直肠囊的胚胎卵批次表面消毒后破碎释放胚胎组织进行原代培养；用相差与吉姆萨（Giemsa）染色显微镜观察细胞与细菌形态；以通用细菌 16S rRNA 与 S. maltophilia 特异性 23S rRNA 基因 PCR 及近全长 16S rRNA PCR 进行分子检测与鉴定，测序后在 NCBI GenBank 比对；按 CLSI 指南用 Kirby?Bauer 纸片扩散法做抗生素药敏试验；按 PubMLST 数据库 S. maltophilia MLST 方案扩增测序 7 个管家基因（atpD、gapA、guaA、mutM、nuoD、ppsA、recA）进行多位点序列分型，并用 PHYLOViZ Online 构建最小生成树展示遗传相关性。

研究结果如下：

建立 R. linnaei 原代细胞培养物及 S. maltophilia 的检测：研究人员从 29 只雌性 R. linnaei 所产单批或混合批次卵建立 8 份原代培养，观察六个月多数培养细胞生长有限，但其中管 T4 出现明显细胞病变，包括进行性细胞收缩、崩解及最终完整细胞丧失；相差显微镜见细胞皱缩、聚团和脱落，吉姆萨染色涂片确认大量细菌存在且无完整蜱细胞，其余七份培养未检出细菌，表明 T4 污染为单一事件；尽管培养基含青霉素与链霉素，细菌仍增殖，符合 S. maltophilia 对β?内酰胺类和氨基糖苷类固有耐药特征，并可能促成 T4 培养恶化。

细菌分离株的分子鉴定：研究人员用通用 16S rRNA PCR 在 T4 培养中检出细菌 DNA，528 bp 扩增子序列与 Stenotrophomonas sp. LQX?11 100% 一致；再用两对 S. maltophilia 23S rRNA 基因 PCR 确认，531 bp 与 1381 bp 扩增子分别与其菌株 142 有 100% 和 99.92% 一致性；将 T4 培养物划线于 Mueller Hinton 琼脂（MHA）长出白色 L15a 与淡黄 L15b 两菌落，近全长 16S rRNA 基因测序均鉴定为 S. maltophilia 并存入 GenBank 相应登录号。

S. maltophilia 分离株的 MLST 分析：研究人员对 L15a 与 L15b 进行七基因 MLST，得到完全相同等位谱（atpD 等位 1、gapA 等位 4、guaA 等位 336、mutM 等位 51、nuoD 等位 25、ppsA 等位 38、recA 等位 1），对应序列型 ST948；基于 MLST 数据的最小生成树显示 ST948 与 ST408 为单一位点变异、与 ST144 为双位点变异且关系密切。

抗生素药敏谱：研究人员对 L15a 与 L15b 做药敏试验，两株表型一致，在测试的 20 种抗生素中对亚胺培南（IPM）、头孢西丁（CX）、阿莫西林?克拉维酸（AMC）、呋喃妥因（NIT）耐药，对美罗培南（MRP）及其余测试抗生素敏感。

讨论部分总结：研究人员指出本研究从 8 份 R. linnaei 胚胎原代培养之一检出并分离 S. maltophilia，所有培养均在标准无菌与表面消毒下建立且仅单一培养阳性，虽不能完全排除污染，但未在其他七份相似处理培养中发现该菌与既往蜱卵中 S. maltophilia 报道相符，提示可能为蜱源，然而因未对完整卵、环境对照及重复批次做 PCR 筛查，来源不能定论，应解释为蜱源培养系统中偶然检出而非与 R. linnaei 自然关联的确定证据；该菌仅从八份之一培养出且两菌落形态虽异但同属 ST948，非独立菌株，也未在额外批次复制，需更多培养、生物学重复与独立分离株研究来评估流行率与意义；吉姆萨涂片见大量胞外杆状菌黏附退化蜱细胞而无细胞内感染，表明在测试条件下胞外增殖，但未定量菌载与生长动力学，增殖推断基于定性镜检与活菌回收；既往文献有 S. maltophilia 于 Amblyomma cajennense 卵及其他蜱微生物组报道，与本研究中表面消毒 R. linnaei 卵回收相符，但不证明垂直传播，可能经雌虫生殖组织转卵或产卵期低水平污染，需传代试验判定；体外该菌在青链霉素存在下仍存活增殖且与培养恶化相关，但无实验直接评估致病性或定量菌载随时间变化，不能确立增殖与恶化因果关系，其关联符合已知 S. maltophilia 产胞外蛋白酶、脂肪酶、毒素和生物膜能力及固有耐药；分子鉴定 >99% 一致且 MLST 为 ST948，该 ST 见于环境与临床，与 ST408、ST144 相近，但 MLST 亲缘本身不能建立生态连接或传播路径，需进一步基因组与流行病学研究；药敏呈典型多重耐药包括对亚胺培南和阿莫西林?克拉维酸耐药，符合 L1/L2 β?内酰胺酶机制，而对美罗培南敏感见于部分环境株，提供蜱相关分离株抗菌谱基线；本研究聚焦探索性分离与表征，药敏为初步表型耐药谱作为环境监测基线，承认无参考质控株和最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）测定是局限性，未来应纳入标准化质控株与扩展药敏板；S. maltophilia 在人多为低毒机会致病菌，在昆虫与螨类等节肢动物宿主中渐有报道并可能参与营养代谢、防御或微生物组稳定，本研究 R. linnaei 来自犬，既往有 R. sanguineus s.l. 蜱及犬皮肤感染中检出报道，但本研究未建立蜱源分离株与犬病的流行病学或生物学关系，其对蜱生理或微生物组互作未知需探究。

结论部分原文翻译：本研究记录了 S. maltophilia 在 R. linnaei 胚胎来源原代细胞培养物中的存在及胞外增殖。该菌通过显微镜观察发现并经 16S 和 23S rRNA 基因扩增测序确认。其在原代细胞培养中的增殖与细胞病变改变及完整蜱细胞丧失相关，表明在测试条件下该菌能在培养系统中持续存在；尽管本研究未确立细菌增殖与所见培养恶化之间的因果关系。遗传分型将源自蜱细胞培养的两分离株归为 ST948，该序列型与既往报告自环境与临床环境的菌株相关。然而，本研究未确立蜱源分离株与人类或兽医疾病之间的流行病学、致病性或传播联系。抗生素药敏谱揭示其对关键β?内酰胺类包括亚胺培南和阿莫西林?克拉维酸耐药，符合 S. maltophilia 的固有耐药机制。这些发现扩展了目前关于 S. maltophilia 在蜱源培养系统中发生的认识，并为蜱相关分离株提供了基线表型和基因型数据，但需更多观察以确定 S. maltophilia 是否与 R. linnaei 形成自然关联或在自然条件下持续存在于蜱内。因此，需要对蜱及蜱卵直接筛查，并结合生态与传播研究，以阐明该发现的生物学相关性。