用于快速检测鳄梨疮痂病菌Elsinoe perseae的qPCR检测方法的开发

《Australasian Plant Pathology》：Development of a qPCR assay for the rapid detection of the avocado scab fungus Elsinoe perseae

　　

Elsinoe perseae是鳄梨疮痂病的病原菌，是澳大利亚鳄梨产业高度优先的生物安全威胁。基于症状的诊断不可靠，形态学鉴定因Elsinoe物种在人工培养基上生长缓慢以及在田间和纯培养中缺乏有性生殖阶段而受到阻碍。因此，一种能够直接从感染果实或叶片组织中检测病原体的快速、可靠的分子诊断工具至关重要。在本研究中，研究人员开发了一种定量PCR（qPCR）检测方法，针对两个基因组区域：rDNA的内转录间隔区1（ITS1）和RNA聚合酶II亚基B（rpb2）基因。该检测方法可采用单重或双重格式。基于ITS和rpb2的检测均能一致地从纯培养物中检测到E. perseae DNA。然而，在感染鳄梨叶片和果实组织中的检测主要依赖于ITS检测，而rpb2检测的灵敏度降低，这很可能反映了多拷贝rDNA区域与单拷贝rpb2基因之间拷贝数的差异。未观察到与其他Elsinoe物种或鳄梨常见真菌病原体的交叉反应。实现了高分析灵敏度，在使用保守阈值Ct≤30时，能够可靠地检测到浓度为103拷贝/μL的合成gBlocks双链DNA和0.1 ng/μL的基因组DNA中的两个靶标。检测性能不受qPCR试剂和仪器平台的微小变化影响。该检测方法为生物安全应用提供了一种快速、灵敏且高度特异的诊断工具，支持对E. perseae潜在入侵的准确检测、监测和早期响应。

**论文解读：基于qPCR的鳄梨疮痂病菌Elsinoe perseae快速检测方法的开发与应用**

**研究背景与问题**
鳄梨疮痂病（avocado scab disease）由病原真菌Elsinoe perseae（同义名Sphaceloma perseae）引起，是墨西哥、中美洲、美国（佛罗里达）、南美洲、非洲及东南亚部分地区鳄梨的重要病害。该病害的经济影响是多方面的：导致果实早落造成产量损失，因表面瑕疵降低商品果产量，以及限制鲜果出口至特定市场。此外，疮痂病斑形成的裂缝为Colletotrichum属等次生病原菌提供了入侵途径。该病原菌在澳大利亚和新西兰被列为高度优先的生物安全威胁，其传入新区域的最可能途径是通过感染果实和种植材料的运输。目前最经济的防控策略是阻止病原菌传入，而这一策略成功的关键在于能否准确、快速地对目标物种进行鉴定。

然而，传统诊断方法面临诸多挑战：基于症状的诊断不可靠，果实症状易与蓟马或螨虫取食伤害、风磨损等机械损伤混淆；有性生殖结构在田间或纯培养中罕见，且Elsinoe属物种无性态的形态特征高度重叠；E. perseae培养困难，生长缓慢且易被次生微生物过度生长；虽然许多Elsinoe物种被认为具有宿主特异性，但近期研究表明同一宿主（如鳄梨）可能携带多个Elsinoe分类单元，因此宿主关联不能作为可靠诊断标准。以往基于ITS1区域的常规PCR检测（Everett等，2011）特异性验证仅限于新西兰的三种Elsinoe物种，亟需在全属范围内进行更广泛的验证。因此，开发一种可直接从受感染组织或培养物中检测E. perseae的快速、灵敏且特异的分子诊断工具势在必行。

**研究内容与结论**
本研究开发并验证了一种基于TaqMan探针的定量PCR（qPCR）检测方法，靶向两个基因组区域：rDNA的内转录间隔区1（ITS1）和RNA聚合酶II亚基B（rpb2）基因。该检测方法可采用单重或双重格式。通过纯培养物DNA和感染植物组织样本的验证，结果表明：ITS靶向检测在纯培养和植物组织中均能稳定检出E. perseae，而rpb2靶向检测在纯培养中表现良好，但在植物组织中的灵敏度显著降低，这归因于多拷贝rDNA区域与单拷贝rpb2基因的拷贝数差异。在分析特异性方面，该检测方法对全部6个E. perseae分离株均呈阳性，对8个佛罗里达新发现的Elsinoe物种（未描述）、11个非鳄梨宿主Elsinoe物种以及14种鳄梨微生物组中常见的子囊菌均无交叉反应（Ct>30），相对特异性和相对灵敏度均达100%。在分析灵敏度方面，使用保守阈值Ct≤30时，合成gBlocks双链DNA的最低可靠检测限为103拷贝/μL，基因组DNA为0.1 ng/μL。此外，该检测方法具有良好的重复性和再现性，且对qPCR试剂和仪器平台的微小变化具有鲁棒性。该研究发表于《Australasian Plant Pathology》。

**主要关键技术与方法**
- **引物与探针设计**：基于GenBank收录的Elsinoe属ITS序列（877条）和rpb2序列（241条）进行多序列比对，设计靶向E. perseae的特异性TaqMan探针和引物，并通过计算机模拟（in silico）验证与背景中非靶标物种（包括Colletotrichum、Fusarium等）的区分能力。
- **样本队列来源**：包括6个E. perseae分离株（5个来自美国，1个来自巴西）、8个佛罗里达未描述Elsinoe物种分离株、11个非鳄梨宿主Elsinoe物种分离株（含澳大利亚本地物种E. leucospermi、E. piri、E. australis、E. fawcettii、E. citricola），以及14种鳄梨相关子囊菌（来自澳大利亚昆士兰大学和布里斯班病理标本馆）。植物组织样本来自佛罗里达热带研究与教育中心（TREC）种质资源圃的Hass、Lula、Miguel等品种的果实和叶片。
- **qPCR检测体系**：采用TaqMan探针化学法，在单重和双重格式下优化反应条件（包括退火温度、引物探针浓度），并利用合成gBlocks双链DNA片段（EpITS-gB和EpRPB2-gB）作为阳性对照，健康鳄梨DNA作为阴性对照。
- **验证框架**：遵循欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）2021年指南及MIQE指南，评估分析特异性（包容性/排他性）、分析灵敏度（检测限）、重复性/再现性及鲁棒性（不同品牌DNA聚合酶、不同实验室和操作人员）。

**研究结果**

**1. 计算机模拟验证**
基于877条ITS序列和241条rpb2序列的比对，在允许引物结合区最多5个错配（3'端最后3 bp无错配）的条件下，ITS引物和探针与所有GenBank中的E. perseae序列匹配，且不匹配任何非靶标物种。对于rpb2，在允许2个错配（3'端最后5 bp无错配）的条件下，引物和探针仅匹配E. perseae，不匹配最近缘物种E. mangiferae。两种引物/探针组合均能准确区分E. perseae与佛罗里达新发现的未描述Elsinoe物种，且不与Colletotrichum、Fusarium等非Elsinoe物种结合。

**2. 单重与双重qPCR性能**
在纯培养DNA测试中，ITS靶向检测在单重和双重格式下的Ct值分别为22.4和22.7（使用10⁴拷贝/μL的gBlocks），rpb2靶向检测的Ct值分别为20.4和20.8，表明双重检测未显著影响灵敏度。靶标E. perseae在所有配置中均呈阳性，而非靶标E. mangiferae等均无扩增（Ct>30）。

**3. 验证结果**
**分析特异性**：所有6个E. perseae分离株的ITS和rpb2靶标均被检测到（Ct 18.6–29.6和18.4–27.1）。所有非靶标真菌（包括佛罗里达未描述Elsinoe物种、其他Elsinoe物种及鳄梨相关真菌）的Ct值均>30，部分产生晚期扩增（Ct 32.9–39.9），但采用保守阈值Ct≤30后，相对特异性和相对灵敏度均为100%。

**检测限**：使用10倍梯度稀释的gBlocks（10⁸–10¹拷贝/μL）和E. perseae基因组DNA（10–10^-4 ng/μL），标准曲线线性关系良好（R2>0.99）。ITS和rpb2靶标在gBlocks浓度10³拷贝/μL时均能可靠检测（Ct分别为29.4和26.4）；基因组DNA最低可靠检测浓度为0.1 ng/μL（Ct分别为23.4和28.5）。

**重复性与再现性**：同一操作人员在相同条件下的三次重复实验均能稳定检出E. perseae分离株（Ct 18.4–24.3 for ITS，22.0–29.9 for rpb2），非靶标无扩增。不同操作人员及不同qPCR仪器（QuantStudio? 5与QuantStudio? 3）的再现性测试中，E. perseae检测结果稳定（Ct 19.9–20.2 for ITS，23.5–24.5 for rpb2），非靶标仍为阴性。

**鲁棒性**：更换DNA聚合酶品牌（从TaqMan? Fast Advanced Master Mix换成GoTaq? qPCR Probe kit）后，特异性未受影响，所有E. perseae分离株和阳性对照均被检出，非靶标无扩增。在佛罗里达TREC实验室由不同操作人员进行的独立验证中，E. perseae分离株的Ct值范围为17.0–23.4（ITS）和22.5–27.1（rpb2），非靶标无扩增。

**4. 植物组织检测**
在佛罗里达采集的8个具典型疮痂症状的果实和叶片样本中，使用ITS引物/探针检出E. perseae（Ct 23.7–29.1），而4个具类似症状但由其他因素导致的样本以及无症状果实均无检出（Ct>30）。感染状态通过Everett等（2011）的常规ITS PCR及Sanger测序验证。值得注意的是，rpb2靶向检测在植物组织中的灵敏度较低，仅1个样本为临界阳性（Ct=30），其余7个样本Ct>30。另外，E. mangiferae分离株TREC-MSVP1在qPCR中无扩增，但在常规PCR中产生扩增产物，表明qPCR特异性更高。

**讨论与结论**
**讨论总结**：近年来对Elsinoe属宿主关联性的理解取得了进展，表明该属内的宿主-病原关系比以往更复杂且更不可预测，非柑橘相关Elsinoe物种可感染柑橘，因此仅依赖宿主关联或症状可能导致误诊。本研究开发的TaqMan qPCR检测方法经过EPPO指南推荐的全套验证，在纯培养中ITS和rpb2靶标均表现可靠，在植物组织中ITS靶标主导检测，而rpb2因单拷贝特性灵敏度较低，更适合作为培养物确认的辅助工具。采用保守阈值Ct≤30可减少假阳性，但可能漏检早期感染样本，建议在接近检测限的结果时进行确认性检测（如Belizaire等，2023所述）。该检测方法对于生物安全监测和检疫执法至关重要，尤其是在澳大利亚等将E. perseae列为高度优先外来威胁的国家。

**结论翻译**：总之，新型qPCR检测方法在检测鳄梨疮痂病菌E. perseae（无论是真菌培养物还是感染植物组织）方面具有特异性、快速性和鲁棒性，使其成为鳄梨疮痂病诊断过程中的宝贵工具。直接检测新鲜果实疮痂病斑中的E. perseae尤为重要，因为国际水果贸易很可能是病原菌传播的最重要途径。检疫人员发现的可疑疮痂症状（即使由其他生物或非生物因素引起）可能导致临时货物扣留，因此需要快速准确地确定E. perseae的存在，以防止不必要的贸易中断。阳性样本可进行确认性测试以验证物种身份，在澳大利亚等将病原菌视为高度优先外来威胁的国家，在启动紧急植物有害生物应急响应之前，这一点尤为关键。随着全球鳄梨产量增加，这一经过验证的qPCR检测方法将支持对E. perseae的准确及时检测，有助于控制病原菌传播、减少作物损失，并降低与遏制、根除或病害管理相关的成本。